Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sinteticnih protocelic

From Wiki FKKT

Revision as of 15:59, 2 May 2020 by Urban Hribar (Talk | contribs)
(diff) ←Older revision | Current revision (diff) | Newer revision→ (diff)
Jump to: navigation, search

Izvorni članek: Joesaar, A., Yang, S., Bögels, B. et al. DNA-based communication in populations of synthetic protocells. Nat. Nanotechnol. 14, 369–378 (2019). https://doi.org/10.1038/s41565-019-0399-9


Contents

UVOD

V sintezni biologiji se sistemi za molekularno komunikacijo med celicami že dolgo časa razvijajo, saj so kritični za razvoj kakršnihkoli večceličnih sistemov. Do zdaj so se v sintezni biologiji predvsem razvijali sistemi za komunikacijo med živimi celicami z malimi molekulami, enako kot to poteka v naravi. Razvilo se je že mnogo različnih sistemov za kompleksno, večsmerno in usklajeno komunikacijo, imajo pa žive celice za razvoj komunikacijskih sistemov tudi precejšne težave. Zaradi izjemne kompleksnosti živih celic se pri razvoju kompleksnih vezij sinteznih genov lahko hitro pojavijo interakcije in tekmovanje z drugimi celičnimi komponentami. Razvoj bolj kompleksnih sistemov komunikacije bi tako morda bil bistveno lažje izvedljiv v bistveno bolj enostavnih sintetičnih protocelicah, kjer imamo bistveno boljši nadzor nad celotnim sistemom.

PROTOCELICE

Do zdaj se sistemov za komunikacijo med neživimi protocelicami ni precej razvijalo. Namen je bil razviti sistem za komunikacijo med protocelicami, ki bi se ga dalo dobro programirati in bi enostavno razširiti. Tako so razvili sistem BIO-PC (Biomolecular implementation of protocelular communication). Sistem deluje za protocelice na osnovi proteinosomov, proteinskih mikrokapsul, ki so prepustne za kratke ssDNA molekule (krajše od 100 baz). Te proteinosomi vsebujejo internalizirana molekularna vezja, ki se lahko odzivajo na in oddajajo signale v obliki ssDNA. Uporabljena DNA vezja delujejo na podlagi toehold-mediiranega izpodriva veriga, ki deluje brez aktivnosti kakršnegakoli encima (DNA strand displasement reactions - DSD). DSD sistemi so zelo predvidljivi, nam omogočajo visoko stopnjo programiranja in se ga da zelo rahko razširiti.

DELOVANJE BIO-PC SISTEMA

DSD sistemi so bili že predhodno razviti in imajo mnogo potencialnih aplikacij. Sistem deluje popolnoma na osnovi molekul DNA in za delovanje ne potrebuje nobenih encimov. V sistemu imamo vsaj 3 verige ssDNA, matično verigo na katero je hibridizirana ali delno hibridizirana output veriga ssDNA (lahko tudi več verig), tretja input veriga se prilega matični verigi in ob njenem dodatku izpodrine prvotno hibridizirano output verigo. Obstajajo sicer še drugačne izpeljave DSD sistemov a to je sistem, ki je bil uporabljen za BIO-PC. Izpodrinjena veriga lahko nato deluje kot signalna veriga za nadalnje DSD reakcije. Z uporabo večih zaporednih DSD sistemov lahko tako ustvarimo raznovrstna logična vezja ali vzpostavimo večsmerno komunikacijo. Ta genetska vezja se ujame v proteinosomske nanodelce, tako da se matično ssDNA vezano na streptavidin lokalizira znotraj proteinosoma. Kratke ssDNA molekule membrano proteinosoma lahko prehajajo in tako omogočajo komunikacijo med nanodelci oziroma protocelicami. Lokalizacija molekularnih vezij nam da mnoge prednosti, saj zaščiti internalizirano DNA pred razgradnjo in tako omogoči delovanje BIO-PC vezij tudi znotraj bolj fiziološko relevantnih sistemov. Enkapsulacija v nanodelce sicer pomeni, da je hitrost signaliziranja odvisna od hitrosti prehajanja signalnih verig skozi membrano proteinosoma. Zaradi visokih lokalnih koncentracij DNA dejansko pride do bistveno hitrejših reakcij in tako delovanje vezja poteka v rangu minut namesto ur. Enkapsulacija v proteinosome ima tudi prednost, da lahko tak sistem lažje razširimo, saj do interakcij pride le pri input in output verigah in nas le tam rabi skrbeti glede ortagonalnosti ter zmanjša možnosti za neželjene hibridizacije. Še večji nadzor nad potjo rekcije pa bi lahko dosegli z koenkapsulacijo večih molekularnih vrat v isti nanodelec.

KASKADNA AMPLIFIKACIJA SIGNALA

S pomočjo BIO-PC tehnologije so uspeli ustvariti več funkcij, kot so kaskadna amplifikacija, dvosmerna komunikacija in logične operacije. Amplifikacijo signala s kaskadami pogosto najdemo v živih velicah in večceličnih organizmih. V primeru BIO-PC so kaskadno amplifikacijo dosegli s pomočjo dveh različnih populacij protocelic, ki so bili nanešeni na trap array z naključno porazdelitvijo. Popoulaciji celic sta bili nanešeni v enakem razmerju. Ko dodamo input verigo ta izpodrine output verigo v popolaciji protocelic 1. Skupaj z izpodrinjeno verigo se odstrani tudi dušilec flourescence in rekcijo v celicah populacije 1 tako lahko spremljamo s povečano stopnjo flourescence barvila Cyp5. Output veriga populacije 1 pa sproži izpodriv output verige v populaciji 2, ki jo lahko preko podobnega mehanizma spremljamo s povečano flurescenco barvila Alexa546. Do amplifikacije signala pride kljub temu, da v populaciji 1 ena imput veriga sproži sprostitev le ene output verige. Ta se zgodi zato ker za populacijo 2 dodamo gorilne (fuel) verigo ki po sproženi reakciji znova izpodrine signalno verigo (output verigo populacije 1), tako da lahko ta veriga aktivira druge protocelice znotraj populacije 2. Z dodatkom gorilne verige tako močno povečamo odziv celic v populaciji 2. Med flourescenco ob reakciji v populaciji 1 in populaciji 2, se kot pričakovano opazi časovni zamik. Ta zamik je daljši če uporabimo protocelice, kot če bi uporabili mešanico v raztopini, ker more output veriga populacije 1 difundirati čez ovoj nanodelcev. Zamik med populacijama 1 in 2 bi tako lahko spreminjali, s spreminjanje permiabilnostnih lastnosti ovoja nanodelca. Kot demonstracijo, da se da sistem še nadalnje razširiti so podoben eksperiment izvedli s tremi različnimi populacijami protocelic. Pri temu eksperimentu output veriga populacije 1 vodi v izpodriv output verige v populacije 2 in ta v izpodriv verige v populaciji 3. Rezultati tega eksperimenta so ustrezali pričakovanjem in odstranitev populacije 2 je onemogočila izpodriv output verige v populaciji 3.

OBOJESMERNA KOMUNUKACIJA MED PROTOCELICAMI

Poleg enosmerne komunikacije je med živimi celicami pogosto kritična obojesmerna komunikacija, ki vključuje oboje pozitivne in negativne regulatorne interakcije. V primeru BIO-PC so ustvarili negativno povratno zanko med dvema populacijama protocelic. Pri populaciji 1 dodana input veriga izpodrine output verigo, ki povzroči izpodrinjenje output verige v populaciji 2. Output veriga populacije 2 pa deluje kot ortagonalni inhibitor za input verigo ki sproži reakcijo v populaciji 1 in prepreči aktivacijo nadalnjih protocelic znotraj populacije 1. Po dodatku input verige tako pride do aktivacije populacije 1, zakasnjene aktivacije populacije 2, temu pa sledi vzporedna deaktivacija populacije 1. Učinkovitost negativne povratne zanke je bila dokazana s tem, da če odstranimo populacijo 2 protocelice v populaciji 1 ostanejo aktivne. Hkrati če populacijama ne dodamo input verige, ki aktivira populacijo 1, ne pride do aktivacije populacije 2, razen minimalne stopnje puščanja.

IZDELAVA LOGOČNIH VEZIJ

Zaradi svoje ortagonalnosti so DSD vezja zelo primerna za opravljanje kompleksnejših logičnih operacij. Različne komponente se da tudi prostorsko ločiti ločiti, kar bi nam omogočilo sestaviti naprave zmožne bolj kompleksnega procesiranja in detekcije signalov. Na osnovi DSD reakcij so predhodno razvili več različnih logičnih vrat, ki bi se jih dalo uporabiti v BIO-PC sistemih. Kot primer implementacije logičnih vezij z BIO-PC sistemom so bila sestavljena enostavna logična vezja iz treh različnih populacij protocelic. Dve od teh populacij so bili enostavni transducerji, tretja populacija pa so bila AND ali OR vrata. Transducerski populaciji aktivirajo dodane input verige, pri AND in OR vratih pa pride do izpodrina verige, ob prisotnosti ene oziroma obeh output verig transducerskih populacij. Ti sistemi so se odzvali glede na dva različna inputa in predvideno delovanje so eksperimentalno potrdili. Poleg tega so izdelali tudi enostavno logično vezje, ki se odziva na tri različne inpute iz 2 populacij protocelic. Ena od teh populacij je dolovala kot AND vrata in drug kot OR vrata. Tudi to logično vezje je delovalo kot pričakovano, kar nakazuje da bi se lahko izdelalo bolj kompleksne sisteme s povezovanjem večih logičnih vrat.

ZAKLJUČEK

BIO-PC tehnologija nam potencialno omogoča sestavljanje zelo kompleksnih logičnih vezij, ki bi se odzvala na biološko relavantne kratke RNA (npr. miRNA) ali ssDNA molekule. Enkapsulacija molekularnih vezij v proteinosome nam razširitev na večja logična vezja še olajša saj nas za nezaželjene hibridizacije rabi skrbeti le pri output in input ssDNA molekulami. Še večji nadzor nad signalno potjo pa bi nam lahko omogočila koenkapsulacija različnih molekularnih vrat. Membrane proteinosomov nam tudi dajejo še dodaten nadzor nad časovnim potekom signalizacije, saj lahko z manipuliranjem lastnosti membrane proteinosoma nadziramo hitrost difuzije output in input verig. Proteinosomska memrana molekularna vrata tudi ščitijo pred razgradnjo, kar omogoča delovanje takih sistemov v biološko bolj relevantnih okoljih. BIO-PC sistemi bi lahko omogočili kompleksno procesiranje informacij in imajo morebiten potencial v diagnostiki ter terapsvtskih aplikacijah. Očitne takojšne aplikacije te tehnologije pa na žalost trenutno še niso vidne.

VIRI

[1] Joesaar, A., Yang, S., Bögels, B. et al. DNA-based communication in populations of synthetic protocells. Nat. Nanotechnol. 14, 369–378 (2019). https://doi.org/10.1038/s41565-019-0399-9

[2] Zhang, D., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nature Chem 3, 103–113 (2011). https://doi.org/10.1038/nchem.957

Personal tools