View source for LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid

Let.it.bee je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je zasnovala skupina podiplomskih študentov iz Univerze São Paulo v Braziliji. Z njim so se uvrstili med prvih deset ekip v kategoriji podiplomskih študentov. Njihov cilj je bil pripraviti rastlino, ki bi reševala problematiko manjšanja populacij čebel zaradi splošne uporabe pesticidov. 

Spletna stran projekta Let.it.bee, iGEM 2021:  [https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil]

Avtorica povzetka: Barbara Jaklič


=='''Čebele in njihov pomen'''==

Kljub svoji majhnosti so čebele kot opraševalke ključnega pomena za ohranjanje številnih kopenskih življenjskih združb. Obstaja preko 20.000 vrst razdeljenih v sedem družin, med katerimi je najbolj znana družina pravih čebel (''Apidae''), kamor spadata rod čmrljev in medonosnih čebel. V Braziliji, od koder prihaja ekipa, je prisotnih okrog 3000 vrst [1], medtem ko jih imamo v Sloveniji okrog 550, predvsem iz rodu peščinskih čebel (''Andrena''). Za človeka je zagotovo najpomembnejša vrsta domača čebela (''Apis mellifera''), katere podvrsta kranjska čebela (''Apis mellifera carnica'') je v Sloveniji avtohtona [2].

Z opraševanjem čebele skrbijo za razmnoževanje številnih rastlinskih vrst in njihovo genetsko variabilnost. Oprašujejo kar 80 % vseh cvetočih rastlin, od tega več kot 130 vrst sadja in zelenjave [3]. Zato imajo poleg okoljskega vidika čebele tudi velik ekonomski pomen. Nekatere vrste sadja kot so kivi, melone, buče in lubenice so popolnoma odvisne od čebeljega opraševanja, brez čebel ne bi imeli niti kakava, brazilskih oreščkov, vanilije in klinčkov. Poleg tega obstajajo številne druge vrste sadja, oreščkov in drugih poljščin, katerih donos v odsotnosti čebel bi se zmanjšal za 40 do 90 %. V to skupino spadajo jabolka, marelice, borovnice, mango, breskve, slive, hruške, maline, mandlji, indijski oreščki, kumare, avokado in celo pšenica [4]. Na splošno se pomembnost čebel odraža v kar eni tretjini vse hrane, ki jo zaužijemo, pridelavi vlaken za oblačila in surovin za biogoriva ter seveda pridobivanju medu in voska. Zaradi navedenih razlogov čebele doprinesejo k 10 % BDP v kmetijskem sektorju [1].


=='''Problem'''==

Na žalost po celem svetu prihaja do upadanja števila čebeljih kolonij. Od konca 20. stoletja pa do danes naj bi izumrla skoraj četrtina nekdaj prisotnih vrst. Posebej za zmanjšanje populacij medonosnih vrst kot je ''Apis mellifera'' se je uveljavil izraz ''sindrom propadanja čebeljih družin'' [5]. Razlogov za to je več, najpomembnejši so zagotovo urbanizacija in z njo kulturno gojenje rastlin ter posledična izguba čebeljega habitata, upadanje dejavnosti čebelarjev, podnebne spremembe, pojav čebelje pršice in varoje ter sistematična uporaba pesticidov [6].

Posebej problematična je nepravilna uporaba pesticidov za zaščito zrnja, predvsem neonikotinoidov kot so klotianidin, imidakloprid in tiametoksam, ki povzročajo akutno zastrupitev čebel.  Nevarne so že subletalne koncentracije, saj se lahko okužijo le posamezne čebele, kar pa zaradi posebne organizacije čebeljega panja lahko vpliva na celotno kolonijo [6].

===Uporaba neonikotinoidov===

Neonikotinoidi so najpogosteje uporabljena skupina pesticidov, čeprav je bila leta 2013 njihova uporaba v Evropski Uniji močno omejena [7]. Spadajo med nevrotoksine, saj delujejo agonistično na nikotinske acetilholinske receptorje (nAChR) v nevronih insektov, ne pa tudi vretenčarjev [8]. Kmetje se največ poslužujejo imidakloprida, saj je zelo učinkovit in v rastlinah deluje sistemsko [9]. 

'''Imidakloprid''' se običajno vnese v rastlino s talnim nanosom v obliki granul ali tekočine, lahko pa tudi z obdelavo semen, od koder se med rastjo razširi po celotni rastlini [8]. Čebele pridejo v stik z imidaklopridom bodisi pri hranjenju z nektarjem, ki predstavlja vir ogljikovih hidratov, ali pri prenosu cvetnega prahu, ki predstavlja vir beljakovin in maščob. V čebelah se ta pesticid pretvori v še nevarnejše metabolite, kar vpliva na njihove motorične in kognitivne sposobnosti (letenje, prehranjevanje in navigacija) [10]. Največja težava pa je, da tako nektar kot cvetni prah čebele nosijo v panj in zato ob stiku s strupeno substanco ne pride do zastrupitve ene same čebele, ampak celega panja [8].


=='''Ideja'''==

Kljub negativnim učinkom imidakloprida je njegova uporaba v kmetijstvu neizogibna, saj predstavlja enega izmed bolj učinkovitih načinov obrambe pred škodljivci, ki bi sicer močno zmanjšali donos ekonomsko pomembnih rastlin. Zato se je ekipa USP-Brazil lotila projekta Let.it.bee, katerega glavni cilj je bil zasnovati tehnologijo, s katero bi zmanjšali toksične učinke neonikotinoidnih pesticidov na čebele [1].

Njihova ideja temelji na dejstvu, da so določene vrste insektov odporne na imidakloprid zaradi povečanega izražanja nekaterih encimov iz naddružine citokromov P450 (CYP), ki sodelujejo pri pretvorbi strupenega imidakloprida v manj nevarne metabolite. Primer takšnih organizmov so vinske mušice (''Drosophila melanogaster''), ki izražajo kar 10- do 100-krat več encima CYP6G1 kakor ostali neodporni insekti [11]. Zato so zasnovali biološki sistem, ki omogoča rastlinam, da izražajo encim CYP6G1 samo v tkivih, s katerimi so v stiku čebele med opraševanjem, torej nektar in cvetni prah. Ostali deli rastline kot so listi in steblo pa ostanejo zaščiteni pred škodljivci, saj v njih ne pride do izgube funkcije pesticida [1]. Encim CYP6G1 metabolizira imidakloprid do intermediatov 4- in 5-hidroksiimidakloprida, ki sta v primerjavi z izhodno spojino manj toksična, poleg tega ju lahko CYP6G1 dodatno razgradi do olefina 4,5 hidroksiimidakloprida. Nastali produkti so tudi bolj hidrofilni od imidakloprida, zato jih žuželka lažje izloči iz telesa [12].

===Razvoj ideje===

Za šasijo so sprva izbrali pogosto uporabljen navadni repnjakovec (''Arabidopsis thaliana''), kasneje pa so za testno rastlino raje izbrali paradižnik, ki je četrta najpomembnejša kulturna rastlina na svetu in celo najpomembnejša, če izvzamemo žitarice. Poleg tega je transformacija paradižnika z uporabo ''Agrobacterium tumefaciens'' zanesljiva in učinkovita, rastline pa se po transformaciji dobro regenerirajo [13]. Natančneje so za šasijo uporabili rastline pritlikavega mikroparadižnika '''Micro-Tom (biokocka BBa_K3890000)''', ki je bil razvit za domače vrtove, in ima dobre eksperimentalne lastnosti, kot sta kratek življenjski krog in majhen genom (samo 950 Mb). Poleg tega rastline ne proizvajajo nektarja, zato je bilo dovolj, da izbran encim za aktivacijo pesticide izrazijo v pelodu [14].

===Načrtovanje konstrukta===

Načrtovali so biološki sistem, vstavljen v binarni vektor, ki temelji na plazmidu Ti ''Agrobacterium tumefaciens''. Poleg bakterijskega ori in selekcijskega markerja za bakterije (zapis za odpornost proti streptamicinu) vsebuje tudi elemente za transformacijo rastlin. Med levim in desnim robom T-DNA regije, ki se integrira v rastlinski genom, se nahaja rastlinski selekcijski marker (zapis za odpornost proti kanamicinu) pod kontrolo rastlinskega promotorja CaMV 35S in vsi elementi sistema, ki omogočajo izražanje CYP6G1 v cvetnem prahu [1]:

* '''Promotor pLAT52 (biokocka BBa_K3890001)''', ki je močan promotor specifičen za pelod. Pri predhodnih raziskavah so dokazali visok nivo izražanja po kontrolo tega promotorja v prašnikih, v preostalih rastlinskih organih praktično nič. Promotor so poleg paradižnika testirali tudi v navadnem repnjakovcu (''Arabidopsis thaliana'') in tobaku (''Nicotiana tabacum''), kjer so prav tako dokazali visoko specifičnost za pelod. To predstavlja prednost pred promotorjem pLAT59, pri katerem so dokazali nizek nivo izražanja tudi v semenih in koreninah.
* '''Zapis za encim CYP6G1 (biokocka BBa_K3890006)''' z optimizirano rabo kodonov za izražanje v paradižniku. V predhodnih raziskavah izražanja v tobaku je bilo ugotovljeno, da lahko v 48 urah encim metabolizira 83 % od 400 μg dodanega imidakloprida [Joussen, 2018]. 
* '''Fuzija dveh samoizrezujočih se peptidov LP4/2A (biokocka BBa_K3890002)''', kar omogoča izražanje dveh proteinov pod kontrolo istega promotorja. 2A peptidi so kratka aminokislinska zaporedja, ki so pogosto prisotna v virusni DNA, cepitev poteče po metodi preskakovanja ribosoma med translacijo. Ribosom pri tem pogosto popolnoma pade dol ali pa sploh ne prekine prevajanja, kar so izboljšali s fuzijo z rastlinskim peptidom LP4 iz semen ''Impatiens balsamina''.
* '''Reporterski gen GUS (biokocka BBa_K330002)''', navzdol od zapisa za encim.


=='''Eksperimenti'''==

Rastline transfromiranega mikroparadižnika so gojili v kontroliranem okolju pri 30 °C, ustrezni vlažnosti in naravnem dnevno-nočnem ciklu. Izolacijo listov in cvetnega prahu so vedno izvajali ob istem času in shranjevali material pri -80 °C. Glavni trije eksperimenti, s katerimi so potrdili delovanje biološkega sistema so bili:
* histokemijsko GUS barvanje peloda, pri katerem so aktivnost β-glukuronidaze detektirali z dodatkom substrata 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Glucuronide (X-Gluc), ki ga encim β-glukuronidaza pretvarja v indigo modro,
* ekstrakcija genomske DNA iz listov in peloda ter validacija prisotnosti vstavljene kasete LAT52 CYP6G1 GUS,
*  kvantifikacijska analiza transkriptoma, za kar so najprej izolirali RNA, sintetizirali cDNA in jo analizirali z RT-qPCR [1].


=='''Model in rezultati'''==

Pripravili so dva mikromodela, ki sta simulirala delovanje detoksifikacijskega encima CYP6G1. Pri prvem so želeli z mutagenezo izboljšati encim, tako da bi razgrajeval tudi druge pesticide, kar so preverjali z molekulsko umestitvijo. Za modelno molekulo so s pomočjo orodja PSI-BLAST izbrali encim CYP3A4. Pri drugem modelu so simulirali stopnjo izražanja encima pod kontrolo promotorja pLAT52 in z dobljenim teoretičnim modelom napovedali stopnjo razgradnje imidakloprida in nastanka razgradnih metabolitov. 
Tretji makromodel je simuliral obnašanje čebel v prisotnosti genetsko spremenjene rastline in predvideval, koliko čebel bi se okužilo s pesticidom, če upoštevamo, da pesticid v panj prinesejo le čebele delavke, in kako razsežen bi bil vpliv zastrupitve.
Iz modelov so predvideli, da popolna razgradnja imidakloprida traja 12 sekund in da so rastline transformirane z Let.it.bee in tretirane z imdaklopridom za čebele 5- do 10-krat manj strupene od divjih rastlin [1].


=='''Viri'''==

[1]	Team:USP-Brazil - 2021.igem.org. https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil (pridobljeno 29. 3. 2022).

[2]	A. Gogala: ''Čebele Slovenije.'' Ljubljana: Založba ZRC 2014.

[3]	B. Randall: ''The Value of Birds and Bees'' - Farmers.gov. https://www.farmers.gov/blog/the-value-of-birds-and-bees (pridobljeno 27. 3. 2022).

[4]	H. Ritchie: ''How much of the world’s food production is dependent on pollinators?'' - Our World in Data. https://ourworldindata.org/pollinator-dependence (pridobljeno 27. 3. 2022).

[5]	M. Hood: ''Colony collapse disorder.'' - Definition, Causes, Effects, & Facts - Britannica. https://www.britannica.com/science/colony-collapse-disorder (pridobljeno 27. 3. 2022).

[6]	''Čebele''. https://sl.wikipedia.org/wiki/Čebele (pridobljeno 28. 3. 2022).

[7]	''Neonicotinoids.'' https://ec.europa.eu/food/plants/pesticides/approval-active-substances/renewal-approval/neonicotinoids_en (pridobljeno 29. 3. 2022).

[8]	E. A. D. Mitchell, B. Mulhauser, M. Mulot, A. Mutabazi, G. Glauser, A. Aebi: A worldwide survey of neonicotinoids in honey. ''Science'' '''2017''', 358(6359), str. 109–111.

[9]	A. Potenza: ''Bees: three-quarters of all honey on Earth has pesticides in it'' - The Verge. https://www.theverge.com/2017/10/5/16424216/honey-neonicotinoids-contamination-honeybees-pollinators-environment (pridobljeno 27. 3. 2022).

[10]	S. Suchail, L. Debrauwer, L. P. Belzunces: Metabolism of imidacloprid in Apis mellifera. ''Pest Manag. Sci.'' '''2004''', 60(3), str. 291–296.

[11]	M. Ihara, K. Matsuda: Neonicotinoids: Molecular Mechanisms of Action, Insights into Resistance and Impact on Pollinators. ''Current Opinion in Insect Science.'' Elsevier Inc. 2018, str. 86–92.

[12]	N. Joußen, D. G. Heckel, M. Haas, I. Schuphan, B. Schmidt: Metabolism of imidacloprid and DDT by P450 CYP6G1 expressed in cell cultures of Nicotiana tabacum suggests detoxification of these insecticides in Cyp6g1-overexpressing strains of Drosophila melanogaster, leading to resistance. ''Pest Manag. Sci.'' '''2008''', 64(1), str. 65–73.

[13]	M. A. Bruce, J. L. Shoup Rupp: Agrobacterium-mediated transformation of Solanum tuberosum L., Potato. V: ''Methods in Molecular Biology.'' Vol. 1864, Humana Press Inc. 2019, str. 203–223.

[14]	B. K. Scott, John Warner, Harbaugh: Micro-Tom: A Miniature Dwarf Tomato. 1989.