View source

Uporaba rastlinske biomase predstavlja eno izmed možnih alternativ fosilnim tehnologijam za produkcijo visoko cenovnih kemikalij. V naravi filamentozne glive proizvajajo encime, ki jim omogočajo razgradnjo rastlinske biomase. Različni tipi mehanizmov za razgradnjo rastlinskih celičnih sten so bili opisani pri saprotrofičnih glivah, vendar je bilo sodelovanje oksidativnih encimov močno podcenjeno. Nedavno odkritje novega razreda oksidativnih encimov, poimenovanih litične polisaharid monooksigenaze (LPMO, angl. lytic polysaccharide monooxygenases), je dramatično razširila koncept encimske razgradnje polisaharidov rastlinskih celičnih sten.  LPMO predstavljajo ključne celulolitične encime, ki delujejo na površini vlaken, kjer posredujejo pri oksidativni cepitvi polisaharidnih verig. V industriji, dodatek LPMO k celulolitičnim mešanicam vodi do zmanjšanja količine encimov potrebne za učinkovito saharifikacijo celulozne biomase.

<h2>Litične polisaharid monooksigenaze</h2>

Znane LPMO so razvrščene v družine AA9, AA10, AA11 in AA13. LPMO imajo v svoji strukturi koordiniran bakrov ion, ki sodeluje pri oksidativni cepitvi substrata.  Večina LPMO iz družine AA9 je sposobna razgraditi celulozo. Encime iz družine AA9 lahko najdemo v nekaterih glivah. Koprofilna gliva Podospora anserina ima 33 genov, ki zapisujejo za encime LPMO iz družine AA9, eden izmed njih je PaLPMO9H. Te LPMO so sposobne oksidativno cepiti celulozo na različnih regijah. 

<h2>Testirani substrati</h2>

Želeli so določiti razgradnje produkte in mesta cepitev encima PaLPMO9H pri likenanu (mahovem škrobu), ječmenovih mešano-vezanih glukanih (MLG), glukomananu (GM) in ksiloglukanu (XyG). Te polisaharide lahko najdemo v celičnih stenah različnih rastlin. Podobno kot celuloza, vsi vsebujejo vsaj nekaj β-D-glukoznih ostankov, povezanih preko (14)-glikozidnih vezi. Likenan in MLG sta linearna polimera β-D-glikozidnih ostankov, ki so med sabo povezani preko (14)- in (13)-glikozidnih vezi. GM sestavljajo enote β-D-glukoze in β -D-manozne, povezane preko (14)-glikozidnih vezi.  XyG je razvejan polisaharid z ogrodjem iz β-D-glukoznih ostankov, povezanih preko (14)-glikozidne vezi, kjer ima večina enot ogrodja substitucijo z α-D-ksilozo in s tem pride do nastanka stranskih verig preko (16)-glikozidne vezi, ki se ponekod razširjajo naprej z (12)-povezanimi β-D-galaktoznimi ostanki, ki so vezani na α-D-ksilozo. 

<h2>Metode dela</h2>  
Encim PaLPMO9H iz glive Podospora anserina so izražali v kvasovki Pichia pastoris.<br />

Vse teste encimske razgradnje so izvedli v 300 μl reakcijskih mešanicah, ki so vsebovale 4,4 μM PaLPMO9H. Po 24-ih urah inkubacije, na 40 °C, so ustavili reakcijo s filtracijo preko membrane, ki je prepuščala samo delce manjše od 10 kDa. Topne produkte v filtratu, ki so se sprostili pri razgradnji, so analizirali.<br />

Filtrate so analizirali na dva načina, pri prvem so opravili analizo z masnim spektrometrom, pri drugem načinu pa so najprej ločili med sabo morebitne izomere s pomočjo ionskega mobilnega spektrometra,  ki je bil direktno sklopljen z masnim spektrometrom.<br />

<h2>Rezultati</h2>
Ugotovili so, da encim PaLPMO9H cepi β-(14)-povezane glukane, tako linearne polimere, kot tudi tiste z razvejanimi stranskimi verigami, saj je prišlo do razgradnje vseh štirih substratov.  Prišlo je do oksidativne cepitve β-(14)- in β-(14; 13)-povezanih glukozidnih substratov. PaLPMO9H oksidativno cepi likenan in MLG, produkti cepitve so ketoni in gem-dioli na nereducirajočih koncih glikozidnih ostankov. Dokazali so tudi aktivnost encima na β-(14)-povezanih heteropolisaharidih, natančneje na XyG.<br />

Sposobnost encima PaLPMO9H, da razgrajuje polisaharide, ki se razlikujejo od celuloze v glikozidni vezi med monosaharidnimi enotami, glikozidni sestavi in/ali prisotnosti stranskih verig, bi lahko predstavljala prednost za glivo pri njenem katabolizmu visoko variabilnih polisaharidov in ravno tako za človeka, pri razvoju optimalnih encimskih mešanic za uporabo v biorafinerijah.