Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
(Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi)
Line 20: Line 20:
V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen ''metJ'', ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena ''metJ'' bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo.
-
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo translacije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.  
+
Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo ''metJ''. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo transkripcije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju.  
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.
Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima ''Ph''ANS in ''At''3GT ter ''Vv''AOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

Revision as of 21:06, 2 May 2017

CRISPRi-mediated metabolic engineering of E. coli for O-methylated anthocyanin production

Antocianini so vodotopni rastlinski pigmenti, ki dajejo cvetovom, listom, steblom] in koreninam višjih rastlin značilno modro, rdečo ali vijolično barvo. Uvrščamo jih med flavonoide. So derivati antocianidinov, ki imajo vezano sladkorno komponento. Iz rastlin jih težko pridobivajo v velikih količinah, izplen kemijske sinteze pa je premajhen za uporabo na industrijski ravni. Raziskovalci so želeli pripraviti sev E. coli, ki bo sintetiziral čim večje količine O-metiliranega antocianina peonidin 3-O-glukozida (P3G).

Sinteza P3G poteče v treh encimsko kataliziranih stopnja iz dostopnega prekurzorja (+) katehina. Prvo stopnjo katalizira encim od alfa ketoglutarata odvisna antocianidin sintaza (PhANS), ki katehin pretvori v cianidin. Nadaljnjo pretvorbo cianidina v cianidin 3-O-glukozid (C3G) katalizira 3-O-glikoziltransferaza (At3GT). Slednja pripne sladkorno enoto na hidroksilno skupino. V zadnji stopnji sledi metilacija 3` OH skupine s pomočjo antocianin O-metiltransferaze (AOMT) in kofaktorja S-adenozil-L-metionina (SAM).


Contents

Antocianin O-metiltransferaze iz različnih organizmov

Začetni korak izboljšav sinteze naravnih produktov v mikrobnih sistemih je iskanje in proučevanje encimov, ki katalizirajo enako kemijsko reakcijo. Gre za iskanje ortologov, ki zapisujejo za encime manj občutljive na povratno inhibicijo, z boljšimi encimskimi lastnostmi in encime z optimalnim izražanjem za določeno sintezo. Na podlagi teh zahtev so izbrali pet antocianin O-metiltansferaz.

Zapise za AOMT so klonirali v plazmide pETM6, ki so v celici prisotni v velikem številu. Sledila je kotransformacija E. coli BL21 s plazmidom pACM4 z nizkim številom kopij na celico, ki je nosil zapise za encima PhANS in At3GT. Vsi konstrukti so bili pod kontrolo promotorja T7lac. Če so celice sprejele oba plazmida, je prišlo do sinteze končnega produkta P3G. Sinteza slednjega je potekla v vseh petih primerih. Največjo so izmerili pri AOMT iz grozdja (VvAOMT), sledili so AOMT iz ciklame (CkmOMT2), paradižnika (SlAOMT) in petunije (PhMF2 in PhMF1). Sinteza z VvAOMT je bila trikrat večja od sinteze s CkmOMT2. Vzrok različne stopnje pretvorbe naj bi bil v učinkovitosti izražanja encima in v afiniteti encimov do substratov. Pri negativni kontroli, sev brez AOMT, ni prišlo do sinteze P3G. To dokazuje, da E. coli BL21 ne vsebuje endogene AOMT.

Število kopij gena vpliva na titer C3G in P3G

Sprva sta bila zapisa za encima PhANS in At3GT na plazmidu pACM4 z nizkim številom kopij na celico. Za povečanje sinteze so zapisa klonirali v plazmid pETM6 z velikim številom kopij na celico, ki je že vseboval zapis za VvAOMT oziroma CkmOMT2. Preverili so tudi stopnjo pretvorbe, če imata encima PhANS in At3GT pripeto oznako maltoza vezavnega proteina (MBP). S prenosom v plazmid z velikim številom kopij na celico, se je sinteza P3G povečala za petkrat. Oznaka MBP je povečala sintezo C3G in P3G samo v primeru VvAOMT, in sicer za devetkrat.

Regulacija metionin in S-adenozilmetionin biosintezne poti s CRISPRi

V naslednjem koraku so raziskovalci želeli preveriti vpliv razpoložljivosti SAM za O-metilacijo antocianinov. V ta namen so utišali gen metJ, ki zapisuje za od liganda odvisen transkripcijski represor (MetJ). Njegova naloga je uravnavanje sinteze metionina in SAM glede na koncentracijo slednjega. Z utišanjem gena metJ bi preprečili inhibicijo sinteze SAM in tako povečali koncentracijo razpoložljivo za O-metilacijo. Raziskovalci so s CRISPRi zavrli transkripcijo metJ. Pripravili so zaporedji, ki sta komplementarni zaporedju tretjega promotorja. Ciljanje tega mesta onemogoči iniciacijo transkripcije na tretjem promotorju oz. elongacijo aktivirano na prvem ali drugem promotorju. Celice so kotransformirali z vektorji, ki so vsebovali zapise za neaktivno Cas9, tracrRNA ter ustrezne crRNA, ter vektorjem z MBP označenima PhANS in At3GT ter VvAOMT. Obe zaporedji sta povečali sintezo P3G za dvakrat glede na negativno kontrolo (netarčna crRNA). Zaključimo lahko, da koncentracija razpoložljivega SAM vpliva na O-metilacijo antocianinov.

Zaključek

Z izborom najboljšega ortologa, optimizacijo števila kopij gena in povečanjem dostopnosti SAM so za enaindvajsetkrat izboljšali sintezo peonidin 3-O-glukozida. Dokazali so tudi, da je CRISPR interferenca uporabno orodje za uravnavanje transkripcije v metabolnem inženirstvu.

Personal tools