View source for Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859 '''Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties''']

Dihidrohalkoni (DHC) so sekundarni rastlinski metaboliti, ki vsebujejo molekule, ki so zanimive za uporabo kot antioksidanti, antidiabetiki in sladila. Nahajajo se v številnih rastlinah, med drugim tudi v grozdju, malinah in jabolkih. Dihidrohalkoni imajo skelet iz 1,3-difenilpropan-1-on-a. Poznamo več kot 200 strukturno različnih dihidrohalkonov. Funkcionalna vloga teh spojin v rastlinah je zaenkrat slabo poznana, veliko pa je zanimanja za njihove učinke za zdravje ljudi.


==Uporaba DHC-jev==
Florizin je hipoglikemično sredstvo in deluje tako, da zavira glukozna transporterja SGLT1 in SGLT2, ki sodelujeta pri absorpciji glukoze v črevesju in reabsorpciji v ledvicah. Uporabili so ga za osnovo pri načrtovanju več kot desetih antidiabetičnih zdravil, trije od teh so bili odobreni s strani FDA in EMA.
Aspalatin in notofagin imata močne antioksidantne učinke in se nahajata v rooibos-u (''Aspalathus linearis''). 
Naringin dihidrohalkon (NDC) in neohesperidin dihidrohalkon (NHDC) sta sladili z 1-kratno in 20-kratno sladkostjo saharina, ki ju lahko kemično sintetiziramo iz citrusnih flavanonov. Neohesperidin dihidrohalkon je v Evropi odobren za uporabo kot aditiv v prehrani (E959).

==Metode dela==
Za subkloniranje genov so uporabili celice ''E. coli''. Kodirajoča zaporedja za izbrane encime so pomnožili s PCR in jih klonirali v ekspresijske kasete plazmidov. Te so z ''in vivo'' homologno rekombinacijo (metoda DNA »assembler«) združili v multiekspresijske plazmide. Vsi eksperimenti (izražanje biosinteznih poti) so potekali v ''S. Cerevisiae''.

==Testiranje reduktaz dvojnih vezi (DBR) za proizvodnjo floretina v kvasovkah==
Pomemben korak pri proizvodnji DHC-jev je redukcija α,β-dvojne vezi v p-kumaroil-CoA. Raziskovalci so testirali reduktaze iz jabolk, ki so bile predhodno omenjene v različnih študijah, vendar z nobenim od teh encimov niso dosegli uspešne aktivnosti v kvasovkah. Namesto tega so izkoristili stransko aktivnost nativne dolgoverižne enoil-CoA reduktaze ScTsc13 iz kvasovke. S čezmernim izražanjem omenjenega encima so uspešno reducirali dvojno vez v p-kumaroil-CoA in dobili floretin. Nastanek naringenina (obsežnega stranskega produkta osnovne poti) pa so znatno zmanjšali z uporabo visoko specifične halkon-sintaze (CHS) iz ječmena. 

==Uporaba ScTsc13 za proizvajanje pinocembrin DHC-ja==
Večina naravno prisotnih DHC-jev izvira iz floretina, nekatere rastline (''Uvaria angolensis'', ''Mitrella kentia'') kopičijo tudi DHC-je, ki nimajo 4-hidroksi skupine. To pomeni, da najverjetneje izhajajo iz pinocembrin DHC-ja in nastanejo s pomočjo encima CHS iz dihidrokiscinamoil-CoA in treh enot malonil-CoA. Ustvarili so seva PIN1 in PIN2, ki sta vsebovala pot za pinocembrin (''AtPAL2'', ''At4CL2'' in ''HaCHS'') z ali brez prekomerno izraženega ''ScTSC13''. Sev PIN1 z nativnim izražanjem ''ScTSC13'', je proizvedel 1.47 ± 0.07 mg/l pinocembrin DHC-ja poleg 11.6 ± 0.3 mg/l pinocembrina. Prekomerno izražanje ''ScTSC13'' v sevu PIN2, je povečalo proizvajanje pinocembrin DHC-ja na 0.43 ± 0.06 mg/l. To dokazuje, da je tudi cinamoil-CoA substrat ScTsc13. 

==Proizvodnja derivatov floretina==
V študiji so opisali tudi proizvodnjo monoglikoziliranih DHC-jev (florezina in notofagina) in NDC-jev z uporabo poznanih od UDP odvisnih glikoziltransferaz (UGT) ter proizvodnjo 3-hidroksifloretina. Proizvodnja različnih derivatov floretina je bila uspešna z dodatkom encimov z znano aktivnostjo za DHC-je ali z izkoriščanjem substratov encimov, ki so naravno prisotni pri biosintezi flavonoidov ali halkonov. 

==Zaključek==
V študiji poročajo o ''de novo'' proizvodnji številnih DHC-jev v mikrobnem gostitelju, z izražanjem celotnih biosinteznih poti, ki vsebujejo 4-9 genov. Raziskovalcem je uspela proizvodnja antioksidanta notofagina, antidiabetika florizina, sladke molekule naringin dihidrohalkona  in 3-hidroksifloretina. V študiji je bila heterologna proizvodnja DHC-jev še kar obsežna, vendar pa bi bilo za ekonomsko izvedljiv industrijski proces potrebno precejšnje zvišanje proizvodnje omenjenih spojin.

==Viri==
M.Eichenberger, B.J. Lehka, C. Folly, D. Fischer, S. Martens, E. Simón, M. Naesby: Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for de novo production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties. Metabolic Engineering. 2017, 39, 80–89.