Metabolomics

ČLANEK: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3663530/

Članek: Metabolite Profiling to Characterize Disease-related Bacteria

Uvod. Pseudomonas aeruginoso uvrščamo med Gram negativno oportunistično bakterijo. Pogosto povzroča vseživljenjske kronične infekcije v pljučih bolnikov s cistično fibrozo (CF). Zaradi tega je za razumevanje okužb s P. aeruginoso ključno razumeti kako se ta oportunistična bakterija prilagaja na spremembe okolja v pljučih bolnikov s CF.

V članku so se posluževali analiz, ki so jim omogočile identifikacijo in kvantifikacijo skupin metabolitov, ki so si sorodni glede kemijskih lastnosti ali sodelujejo v isti presnovni poti, pravimo da so metabolitom določili profil (metabolite profiling). Osnovni koncept je ta, da se fenotipske profile, oz. metabolomske profile, lahko uporabi za razvrščanje ˝single-gene knockout˝ sevov na podlagi predpostavke, da se bodo funkcionalno sorodni geni združili skupaj (gene cluster). Za ˝single-gene knockouts˝ spremembe je večja verjetnost, da se bodo večje spremembe kazale pri metabolitih kot na transkripcijskem nivoju, zato je bolj smiselna analiza na nivoju metaboloma. To potrjujejo tudi dosedanji eksperimenti na tem področju - metabolne spremembe so veliko pomembnejše od npr. sprememb v rasti mikroorganizmov.

Za študij P. aeruginosa imamo na voljo celotno genomsko knockout knjižnico (PA14NR). Knjižnica zajema PA14 single-gene knockout mutante pridobljene s transpozoni, identificirana so tudi mesta kjer je transpozon vključen znotraj vsakega mutanta. V članku so preučevali možnosti uporabe presnovnega footprinting (analiza celotnega zunajceličnega metaboloma) pristopa za karakterizacijo širokega spektra vzorcev kot je celotna knockout genomska knjižnica.

Izbranih je bilo 86 mutantov iz PA14NR knjižnice. Vsi sevi so rasli v sintetičnem CF mediju (1mL SCFM) v mikrotitrski plošči s 96 vdolbinami. Eksperiment se je izvajal v petih replikacijah (5 plošč).

Analize, rezultati, diskusija. NMR je zelo uporabna metoda pri metabolomskih študijah. Kvantificirali so 25 metabolitov iz spektra, 8 od teh je izločala večina sevov, 17 pa jih je bilo prisotnih v prvotnem mediju in so bili različno porabljeni. 5 od 8 metabolitov, ki so jih izločali sevi so bili tudi identificirani (etanol, format, acetat, piruvat in glukonat).

Biološko ovrednotenje glede na funkcionalno združevanje Glavni cilj študije je bil ugotoviti ali bo na podlagi NMR rezultatov analiz eksometaboloma možno določiti tiste knockout mutante, ki imajo podobno funkcijo. Analiza je pokazala, da se kopije mutantov analizirane pri različnih ponovitvah (analizirali so 5 plošč) združujejo tesno skupaj kar kaže na dobro ponovljivost rezultatov. Večina mutantov je zrasla do podobne končne A600 kot wt, nekateri so imeli pa očitne napake v rasti. V nadaljevanju so se posvetili dvo-komponentnem regulatornemem sistemu, ki zajema membransko histidinsko kinazo in citoplazemski regulator odgovora na določen stimulus. Kinaza/regulator mutirani pari so tvorili ločene skupke pri očitni razliki od wt.

Posledice mutacij na metabolizem Laktat je bil glavni vir ogljika v SCFM - pri večini sevov je bila poraba laktata močno povezana z rastjo. Pri sevih z mutacijo genov, ki so odgovorni za sintezo molekul pri ˝quorum sensing˝ je bila opazna neučinkovita uporaba laktata. Porabili so skoraj vso zalogo laktata, zrasli pa niso do pričakovane velikosti. 2 od izločenih metabolitov sta bila prisotna v visokih količinah pri nekaterih sevih: glukonat in piruvat. Piruvat so preveč izločali aceE in aceF mutanti, glukonat pa cbrA, cbrB, največ pa rpoN mutanti.

Karakterizacija rpoN mutacije Potrdili so ključno vlogo rpoN pri presnovi dušika, saj je bil mutant sposoben uporabiti le 23 virov dušika, medtem ko jih je wt 52. Presenetljivo je rpoN mutant pokazal višjo aktivnost kot wt na številnih ogljihovih virih. Zakaj rpoN okvarjeni sevi izločajo glukanat? Dokazali so da je pri rpoN mutantu za več kot 5x povišana tudi aktivnost glukonat dehidrogenaze v primerjavi z wt kar nakazuje, da je povečana koncentracija glukanata posledica nepravilnega delovanja presnovnih encimov in ne zmanjšanega prevzema glukanata v celice. Glukonat je bil povišan tudi pri cbrA in cbrB mutantih. Skupaj z rpoN predstavljajo pozitivne regulatorje kratke nekodirajoče regulatorne RNA crcZ. Ta se veže na protein crc, ki regulira številne presnovne gene tako da zavira translacijo. Po analizi z glukonatnim testom so potrdili hipotezo, da crcZ knockout mutant proizvaja veliko več glukonata kot wt, pri crc knockout pa je količina glukonata enako kot pri wt.

Klinična uporabnost 25 od 156 izolatov pacientov je imelo povišano produkcijo glukonata. Izmed vseh izolatov so jih nato izbrali 96 in merili minimalno inhibitorno koncentracijo pri petih različnih antibiotikih (tobramicin, imipenem, ciprofloksacin, colistin, aztreonam). Izkazalo se je, da imajo izolati s povišano produkcijo glukonata nekoliko zmanjšano občutljivost na antibiotike.