Mezenhimske matične celice nove generacije: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
No edit summary
No edit summary
Line 11: Line 11:
MMC so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in tudi številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.
MMC so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in tudi številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.


  == IZBOLJŠANJE KEMOTAKSE MMC ==
== Sintezna biologija ==
 
=== Izboljšanje kemotakse ===
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji z specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop Ca ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, in študije kažejo neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.  
Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji z specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop Ca ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, in študije kažejo neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje.  
V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so  v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. Zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov so v kasnejših fazah prešli na uporabo elektroporacije.  
V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so  v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. Zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov so v kasnejših fazah prešli na uporabo elektroporacije.  
== SLEDENJE CELICAM ==
=== Sledenje celicam ===
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje.  V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim luciferaza 2-moonoksigenazo iz meduze Renilla reniformis (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo rekacije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata luciferina pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina vnešene MMC opazujemo in vivo s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence in vivo).
Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje.  V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim luciferaza 2-moonoksigenazo iz meduze Renilla reniformis (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo rekacije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata luciferina pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina vnešene MMC opazujemo in vivo s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence in vivo).
Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega feritina (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). Feritin lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.  
Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega feritina (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). Feritin lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.  


== Oblikovanje samomorilnega stikala =
=== Oblikovanje samomorilnega stikala ===
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-β. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz α- aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.  
Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-β. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz α- aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic.  
V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-β izražajo α-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-β dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.  
V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-β izražajo α-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-β dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale.  
Ta poskus je bil zasnova ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.  
Ta poskus je bil zasnova ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.  
== TESTIRANJE IZBOLJŠANIH MMC ==
== Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ==
Delovanje MMC nove generacije so in vitro preverili na 3 nivojih:  
Delovanje MMC nove generacije so in vitro preverili na 3 nivojih:  
- Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC hranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipoctie s pomočjo pretočne citometrije s katero so zaznali izražanje specifičnih površinskih označevalcev.  
- Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC hranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipoctie s pomočjo pretočne citometrije s katero so zaznali izražanje specifičnih površinskih označevalcev.  
Line 28: Line 30:
- Izboljšanje kemotakse so testirali z poskusi in vitro ter na živalskih modelih vnetnih bolezni. In vitro so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.  
- Izboljšanje kemotakse so testirali z poskusi in vitro ter na živalskih modelih vnetnih bolezni. In vitro so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.  


Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic in vivo so ustvarili mišje modele dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja (VBČ; ang. inflammatory bowel disease oz. IBD) in zakasnjene preobčuljivosti (ang. DTH – delayed type hypersensitivity). Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi z kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.   
Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic ''in vivo'' so ustvarili mišje modele dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja (VBČ; ang. inflammatory bowel disease oz. IBD) in zakasnjene preobčuljivosti (ang. DTH – delayed type hypersensitivity). Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi z kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene.   
Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.  
Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni.  
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in proti-vnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkvinih rezinah črevesja. In vivo so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.  
Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in proti-vnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkvinih rezinah črevesja. In vivo so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra.  
Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in proti-vnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.
Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in proti-vnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.


== REZULTATI ==
== Rezultati ==
1. Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.  
1. Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev.  
2. S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.
2. S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev.
Line 40: Line 42:
5. Spremenjene mezenhimske matične celice  so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja  v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.  
5. Spremenjene mezenhimske matične celice  so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja  v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH.  
6. S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.  
6. S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.  
== PRIHODNOST ==
== Prihodnost ==
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko in vivo spremljamo in zaznamo njihovo diferenciacijo.  
Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko in vivo spremljamo in zaznamo njihovo diferenciacijo.  
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal proti-vnetno delovanje celic.  
V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal proti-vnetno delovanje celic.  

Revision as of 21:15, 21 November 2016

MSCavalry - Next generation Mesenchymal stem cells [1]

Uvod

Mezenhimske matične celice (MMC) so obetavne kandidatke za celično zdravljenje vnetnih bolzeni, kot je vnetna bolezen črevesja, zaradi njihovih sposobnosti zaviranja tako pridobljenega kot naravnega imunskega odziva. Klinični poskusi pa so pokazali, da po sistemski administraciji zelo majhen delež celic prispe do mesta vnetja in opravi svojo funkcijo zaradi neučinkovite kemotakse. Na mednarodnem tekmovanju iz sintezne biologije iGEM v letu 2016 je sodelovala ekipa iz Univerze Sun Yat-sen iz province Guangdong na Kitajskem z naslovom SYSU-Medicine, ki se je za svoj projekt odločila, da bo ustvarila izboljšane človeške mezenhimske matične celice (MMC) oziroma MMC nove generacije. V ekipi SYSU-Medicine so želeli s pomočjo sintezne biologije ustvariti mezenhimske matične celice z izboljšano sposobnostjo usmerjenega in specifičnega potovanja na mesta z vnetjem. Za potrebe dokazovanja izboljšanih sposobnosti celic so uporabili označevalne proteine, ki so omogočili sledenje celicam tako in vitro kot in vivo. Zdravilno delovanje celic so preizkusili tudi in vivo na mišjih modelih za dve pogosti vnetni bolezni: vnetno bolezen črevesja (VBČ) ter na modelu zakasnjene preobčutljivosti (ang. delayed type hypersensitivity oz. DTH), ki je služil kot model za alergijski kontaktni dermatitis. Kot cilj so si zadali tudi oblikovati samomorilno stikalo, ki bi se sprožilo ob morebitni diferenciaciji mezenhimskih matičnih celic in s tem preprečilo njihov nenadzorovano delovanje v gostiteljskem organizmu.

Vnetje

Vnetje je proces, ki je osnova številnih bolezni in hkrati nendomestljiv del procesa obnavljanja poškodovanega tkiva. Pri vnetju pride do kompleksnih interakcij med povzročitelji bolezni ali alergeni in imunskim sistemom, pri čemer imajo ključno vlogo kemokini in citokini. Ti delujejo kot prenašalci sporočil in se vežejo na specifične receptorje na površini tarčnih celic in vzpodbudijo sintezo dodatnih vnetnih signalnih molekul, ki povzročijo širjenje žil in prehod imunskih celic iz krvi v vneta tkiva. Če vnetje uide izpod nadzora, lahko pride do obsežne fibroze tkiva. V zadnjih letih je na področju zdravljenja vnetnih bolezni veliko pozornosti usmerjene tudi v razvoj celične terapije z mezenhinskimi matičnimi celicami.

Mezenhimske matične celice

MMC so odrasle multipotentne matične celice, ki so prisotne v različnih tkivih kot so kostni mozeg, maščobno tkivo, periferna kri, zobna pulpa in tudi številna embrionalna tkiva. MMC imajo sposobnost samoobnove in diferenciacije v več različnih celičnih tipov: osteoblaste (kostne celice), hondrocite (celice hrustanca) in adipocite (maščobne celice). Izločajo avtokrine in parakrine dejavnike, ki promovirajo nastanek žil (angiogenezo), zmanjšujejo vnetje in pospešujejo obnovo tkiva. Zaradi sposobnosti uravnavanja imunskega odziva je ena najbolj obetavnih možnosti uporabe mezenhimskih matičnih celic v zdravljenju vnetnih bolezni. Njihovo uporabnost omejuje nizka učinkovitost dostave celic na tarčna mesta in nespecifična distribucija v telesu pri vnosu z injekcijo v krvni obtok.

Sintezna biologija

Izboljšanje kemotakse

Kemokini so signalne molekule ki nadzorujejo migracijo in lokalizacijo imunskih celic, kar je ključno za njihovo gibanje pri imunskem odzivu. Kemokinski receptorji so transmembranski proteini, ki po interakciji z specifičnim kemokinskim ligandom omogočijo vstop Ca ionov v celico, kar sproži kemotakso. Mezenhimske matične celice gojene v kulturi kemokinske receptorje, odgovorne za navigacijo celic na mesta vnetja, izražajo v nizkih količinah, in študije kažejo neučinkovito dostavo na tarčna mesta pri uporabi za zdravljenje. V teoriji bi večje število receptorjev za vnetne citokine na površini celic omogočilo učinkovitejše zaznavanje citokinov in potovanje na mesto vnetja. S pomočjo metode kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) so ugotovili, da se pri modelu VBČ najbolj izraža kemokin CXCL12, ki se veže z receptorjem CXCR4, pri DTH pa CXCL13, ki mu ustreza kemokinski receptor CXCR5. Zato so v mezenhimske matične celice namenjene uporabi za posamezen model bolezni vstavili zapisa za pripadajoče specifična receptorja CXCR4 in CXCR5 pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja-1 α (EF-1 α), ki omogoča konstitutivno izražanje. Konstruktom so dodali še zapis za fluorecenčna reporterska proteina eGFP (varianta zelenega fluorescenčnega proteina) ali dTomato pod istim promotorjem, kar je omogočilo preverjanje ustrezne ekspresije sistema transformiranih celich s fluorescenčno mikroskopijo. V začetnih fazah poskusov so za transfekcijo celic uporabili lentivirusni ekspresijski vektor zaradi visoke učinkovitosti. Zaradi onkogenega tveganja pri uporabi lentivirusov so v kasnejših fazah prešli na uporabo elektroporacije.

Sledenje celicam

Da bi lahko zaznali spremembe v migraciji celic, so potrebovali sistem za vizualizacijo celic in sledenje celicam v živem organizmu, za kar fluorescenčni proteini večinoma niso primerni zaradi težav z avtofluorescenco molekul v celicah, ki povzroči visoko ozadje. V ta namen so v konstrukt dodatno vnesli zapis za encim luciferaza 2-moonoksigenazo iz meduze Renilla reniformis (RLuc). Luciferaze so oksidativni encimi, ki katalizirajo rekacije pri katerih se sprošča svetloba in povzročijo bioluminiscenco. Ob dodatku substrata luciferina pride do sproščanja svetlobe, ki jo lahko zaznamo z ustreznimi aparaturami. S pomočjo luciferaze lahko po injekciji luciferina vnešene MMC opazujemo in vivo s pomočjo IVIS spektra (sistem za spremljanje luminiscence in vivo). Da bi omogočili uporabo spremenjenih mezenhimskih matičnih celic v predkliničnih raziskavah, so kot končni konstrukt oblikovali plazmid, ki je poleg zapisa za kemokinski receptor vseboval zapis za luciferazo, reporterski protein dTomato in težko verigo človeškega feritina (hFTH) pod kontrolo promotorja elongacijskega faktorja 1-α (EF1-α). Feritin lahko zaznamo s pomočjo magnetne resonance in zapis zanj na plazmidu omogoča alternativen način zaznavanja mezenhimskih matičnih celic v živem organizmu.

Oblikovanje samomorilnega stikala

Učinkovitost vnosa MMC, preživetje celic, njihov fenotip in aktivnost so močno odvisni od mikrookolja na mestu vnosa. Le to ima lastnosti rane med celjenjem in vsebuje imunske celice, novo nastalo žilje in citokine, ki pospešujejo fibrozo oziroma brazgotinjenje tkiva kot je TGF-β. Takšno okolje lahko sproži diferenciacijo MMC v krčljive miofibroblaste, ki sintetizirajo stresna vlakna iz α- aktina iz gladkih mišičnih celic (α-SMA), kar vodi v povečanje brazgotinjenja tkiva in izgubo proti-vnetnih lastnosti celic. V okviru projekta so s pomočjo kvantitativnega PCR dokazali, da MMC ob stimulaciji z TGF-β izražajo α-SMA v visokih koncentracijah. Odločili so se to lastnost izkoristiti za zaznavanje diferenciacije MMC. Oblikovali so biološki del, kjer so gen za fluorescenčni reporterski protein eGFP postavili pod kontrolo SMA promotorja. Dokazali so, da ob stimulaciji celic z TGF-β dobijo fluorescenco reporterskega proteina in s tem lahko zaznajo celice, ki so se diferencirale. Ta poskus je bil zasnova ki jo bodo v prihodnje uporabili za oblikovanje samomorilskega stikala, ki bo ob zaznavanju diferenciacije MMC sprožilo apoptozo celice.

Testiranje izboljšanih mezenhimskih matičnih celic

Delovanje MMC nove generacije so in vitro preverili na 3 nivojih: - Ohranjanje fenotipa: preverili so ali so spremenjene MMC hranile sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondrocite in adipoctie s pomočjo pretočne citometrije s katero so zaznali izražanje specifičnih površinskih označevalcev. - Ekspresija sistema: s pomočjo kvantitativnega PCR so preverili izražanje vstavljenega gena za kemokinske receptorje in tudi fluorescenco reporterskih proteinov s fluorescenčno mikroskopijo - Izboljšanje kemotakse so testirali z poskusi in vitro ter na živalskih modelih vnetnih bolezni. In vitro so izvedli test kemotakse pri katerem celice migrirajo skozi filter v smeri raztopine, ki vsebuje visoko koncentracijo kemokinov.

Za testiranje terapevtskega potenciala izboljšanih mezenhimskih matičnih celic in vivo so ustvarili mišje modele dveh pogostih vnetnih bolezni: vnetne bolezni črevesja (VBČ; ang. inflammatory bowel disease oz. IBD) in zakasnjene preobčuljivosti (ang. DTH – delayed type hypersensitivity). Stanje živali zdravljenih s spremenjenimi mezenhimskimi matičnimi celicami so primerjali z tistimi zdravljenimi z kontrolnimi MMC in z živalmi, ki niso bile zdravljene. Model vnetne bolezni črevesja so dobili s pomočjo kemijske indukcije z 2, 4, 6 – trinitrobenzensulfonsko kislino (TNBS). Intrarektalna administracija TNBS povzroči vnetje črevesja z histopatološkimi najdbami podobnimi kot pri Chronovi bolezni. Spremljali so prisotnost znakov bolezni, preživetje, koncentracijo pro- in proti-vnetnih citokinov v črevesju ter infiltracijo levkocitov v tkvinih rezinah črevesja. In vivo so pri miših tretiranih s transformiranimi MMC preverjali usmerjenost celic na mesto vnetja s pomočjo IVIS spektra. Miši z zakasnjeno preobčutljivostno reakcijo so uporabili kot eksperimentalni model za človeški alergijski kontaktni dermatitis. Zakasnjeno preobčutljivost so inducirali z uporabo raztopine fluoro-2, 4- dinitrobenzena (DNFB) tako, da so miši najprej senzitizirali preko kože na hrbtu in nato po enem tednu raztoptini DNFB izpostavili kožo na ušesih. Merili so debelino ušes (oteklino) in infiltracijo levkocitov v tkivnih rezinah, koncentracijo pro- in proti-vnetnih citokinov v ušesih. Prisotnost mezenhimskih matičnih celic so preverili z imunofluorescenco tkivnih rezin ušesa.

Rezultati

1. Transformirane mezenhimske matične celice so ohranile sposobnost diferenciacije v različne celične podtipe in izražanje značilnih površinskih označevalcev. 2. S sintetiziranimi konstrukti so dosegli znatno povišanje izražanja kemokinskih receptorjev. 3. Spremenjene MMC so imele značilno izboljšano sposobnost kemotakse in vitro. 4. S pomočjo reporterskih proteinov so uspešno vizualizirali celice tako in vitro kot in vivo. 5. Spremenjene mezenhimske matične celice so značilno izboljšale simptome bolezni, podaljšale preživetje, zmanjšale infiltracijo levkocitov na mesto vnetja, zmanjšale izražanje pro-vnetnih in povišale izražanje proti-vnetnih citokinov in imele boljše sposobnosti migracije na mesto vnetja v primerjavi s kontrolnimi MMC tako pri modelu VBČ kot pri modelu DTH. 6. S pomočjo oblikovanega reporterja so uspešno zaznali diferenciacijo celic.

Prihodnost

Ekipa je za svoje delo prejela nagrado za najboljši terapevtski projekt in tudi za najboljši sestavljeni biološki del. Uspelo jim je sintetizirati mezenhimske matične celice z izboljšanimi protivnetnimi lastnostmi, ki jih lahko in vivo spremljamo in zaznamo njihovo diferenciacijo. V prihodnjih poskusih napovedujejo dokončno izvedbo samomorilnega stikala, ki bi se sprožilo ob zaznavanju diferenciacije celic ter vnos zapisa za interlevkin-10, ki bi dodatno izboljšal proti-vnetno delovanje celic.


Seminarji SB 12016/17