View source for MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni

miBiome (http://2018.igem.org/Team:Oxford) je projekt študentske skupine iz Oxforda, ki je bil nagrajen za najboljši dodiplomski terapevtski projekt na tekmovanju iGEM 2018. 

Avtor povzetka: Ernest Šprager 

== Kronična vnetna črevesna bolezen ==

Med kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB) uvrščamo Crohnovo bolezen in ulcerozni kolitis. Za ti avtoimunski obolenji je značilno vnetje črevesne sluznice, ki vodi v diarejo, pojavijo pa se bolečine v trebuhu. Prizadeneta 0,3 % populacije, njuna incidenca pa se povečuje predvsem v državah v razvoju. Zdravimo ju simptomatsko s kortikosteroidi, kar pa je po navadi drago in zamudno. Patofiziološko je za KVČB značilno porušeno razmerje populacij celic med Th17 (celice T pomagalke 17) in Treg (regulatornimi limfociti T) v prid prvih. iGEM skupina z Oxforda je poskušala razviti probiotični bakterijski sev, ki bi ponovno vzpostavil zdravo razmerje med obema populacijama in bi omogočal kurativno zdravljenje<ref name="prvi">2018 iGEM Oxford, MiBiome. Prosto dostopno na: http://2018.igem.org/Team:Oxford [28. 12. 2018]</ref>.

=== Imunološko ozadje ===

Sprožilec vnetja je največkrat poškodba črevesnih epitelijskih celic (npr. zaradi patogene bakterije), stik s sproščenimi intracelularnimi snovmi (človeku lastni antigeni) pa nato povzroči abnormalen imunski odziv. Diferenciacijo naivnih celic T v Th17 ali Treg sprožijo številne molekule, smer diferenciacije pa je odvisna od ravni koncentracij prisotnih molekul<ref name="prvi" /><ref name="drugi">J. Gálvez, „Role of Th17 Cells in the Pathogenesis of Human IBD“, ISRN Inflamm., let. 2014, str. 1–14, 2014</ref>. Npr. nizka raven TGFβ favorizira diferenciacijo v Th17, med tem ko je pri višjih koncentracijah in ob odsotnosti nekaterih drugih vnetnih citokinov diferenciacija v Treg večja. Th17 nato z različnimi provnetnimi citokini (IL-17) privlačijo in aktivirajo granulacite ter makrofage in v epitelijskih ter fibroblastnih celicah povzročijo izločanje dodatnih provnetnih molekul. Na drugi strani Treg delujejo imunosupresivno s preprečevanjem produkcije citokinov in zaviranjem aktivacije  Th in citotoksičnih limfocitov T<ref name="drugi" />.

== Zasnova naprave == 

Vsako vplivanje na populacijo limfocitov T pa lahko vodi v stanje imunske pomanjkljivosti (tj. stanje, kjer se telo ne more uspešno braniti pred infekcijami). To je še posebej problematično v regijah s slabo sanitarno higieno, kjer so infekcije pogostejše. Skupina iz Oxforda je ta problem elegantno rešila z razvojem sistema, ki posredno spremlja velikosti populacij Th17 in Th ter na podlagi odstopanja od idealnega stanja izzove aktivacijo enih ali drugih, da se ponovno vzpostavi normalno ravnotežje med njima. Zamišljena probiotična bakterija vsebuje več elementov: sistem za izločanje IL-10 (stimulacija celične diferenciacije v Treg v odvisnosti od NO), RNA̶ stikalo (regulacija izločanja IL-10 v odvisnosti od adenozina) in stikalo za uničenje (biološko varna uporaba). Prednost adenozina in NO kot nizko molekularnih metabolnih markerjev aktivnosti Treg oziroma Th17 v primerjavi z interlevkini je v neprepustnosti bakterijske membrane za slednje<ref name="prvi" />.

=== Izločanje IL-10 kot odziv na povišano raven NO === 

Do izločanja IL-10 pride v prisotnosti NO in odsotnosti povečane koncentracije ekstracelularnega adenozina. Pravijo, da so se za uporabo NO odločili tudi zato, ker so ga uporabili že druge skupine (Stanford 2009: sklopili so ga z sintezo retinojske kisline<ref name="tretji">2009 iGEM Stanford, Project. Prosto dostopno na: http://2009.igem.org/Team:Stanford/ProjectPage [28. 12. 2018]</ref>, Brazilija 2011: prav tako sinteza IL-10<ref name="četrti">2011 iGEM UNICAMP-EMSE, Prosto dostopno na: http://2011.igem.org/Team:UNICAMP-EMSE_Brazil [28. 12. 2018]</ref>). Ta sistem vsebuje transkripcijski faktor SoxR (angl. superoxide stress response), ki se konstitutivno izraža in SoxS promoter, kamor se veže. SoxR je dimerni protein, ki ga aktivira reverzibilna oksidacija vsebujočega klastra [2Fe-2S] z NO (lahko tudi superoksidni anion), s čimer pride do konformacijske spremembe in vezave na promotor SoxS in s tem pričetka transkripcije zapisa za IL-10<ref name="prvi" /><ref name="peti">S. Watanabe, A. Kita, K. Kobayashi, in K. Miki, „Crystal structure of the [2Fe-2S] oxidative-stress sensor SoxR bound to DNA“, Proc. Natl. Acad. Sci., let. 105, št. 11, str. 4121–4126, mar. 2008</ref>. Za zapisom za IL-10 so dodali še zapis za C-terminalno oznako HylA (50-60 ak), ki omogoča izločanje IL-10 iz celice s hemolizinskim transportnim sistemom. Ta je sestavljen iz proteinov HlyB (ABC transporter – prenos skozi notranjo membrano v periplazmo), HlyD (sklopitev prenosa z notranje do zunanje membrane) in TolC (tvorba kanala v zunanji membrani)<ref name="četrti" />. Zapise za IL-10 in kompleks HlyD/HlyB/TolC so združili v en operon pod kontrolo promotorja SoxS, tako da pride do hkratne produkcije in izločanja iz celice samo takrat, ko je NO prisoten<ref name="prvi" />. 

=== Negativna povratna zanka Izločanje IL-10 kot odziv na povišano raven adenina z RNA-stikalom ===

Med poškodbo ali celičnim stresom se iz celic sprosti ATP, ki se pretvori v AMP in nato v adenozin z membranskimi encimi Treg. Ekstracelularen adenozin ima imunoregulatorno vlogo saj zavre aktivacijo efektorskih T celicah, poveča sproščanje IL-10 iz zrelih dendritičnih celic in tako prepreči prekomerni imunski odziv<ref name=»"šesti>A. Ohta in M. Sitkovsky, „Extracellular Adenosine-Mediated Modulation of Regulatory T Cells“, Front. Immunol., let. 5, jul. 2014</ref>. Prevelika količina adenozina bi zato lahko pomenila prekomerno število oz. aktivnost Treg, kar bi lahko vodilo v imunsko pomanjkljivost. Skupina je zamišljeno probiotično bakterijo opremila z membransko adenozinsko hidrolazo, ki ekstracelularen adenozin pretvori v adenin. Ta oddifundira v citoplazmo in zavira sproščanje IL-10 (negativna povratna zanka). Izbira pretvorbe na membrani je ključna, saj bi adenozin v periplazmi tam prisotna deaminiza pretvorila v inozin, ki pa se ne more vezati na RNA-stikalo, vnos citoplazemske hidrolaze pa bi lahko porušil metabolno homeostazo bakterije. Za prenos hidrolaze na membrano so uporabili bakterijski sekrecijski sitem tipa II (C-teminalna sekrecijska oznaka) in dodali skrajšano zaporedje membranskega proteina YiaT, s katerim so encim zasidrali na membrano. Ker je hidrolaza aktivna le v dimerni obliki, s tem sistemom pa lahko transportiramo le monomerne oblike, so hidrolazi povezali med sabo z dolgim povezovalni zaporedjem, ki je omogočal tvorbo dimerov na površini celice<ref name="prvi" />.  

Za utišanje izražanja IL-10 si je skupina zamislila konstrukt sestavljen iz RNA-stikala PbuE, ribocima HDV (angl. Hepatitis delta virus) in sRNA (angl. small regulatory RNA). Adenin se v citoplazmi bakterije veže na aptamerno domeno RNA-stikala PbuE v mRNA konstrukta, s čimer se ob vezavi poruši terminatorska zanka in transkripcija lahko poteče do konca – prepišeta se še ribocim HDV in sRNA<ref name="prvi" />. Slednje vsebuje zaporedje komplementarno IL-10 mRNA (veže se na regijo iniciacije translacije)  in skrajšano zaporedje nekodirajoče RNA MicC (ti. scaffold zaporedje), kamor se veže protein Hfq. Slednji protein promovira hibridizacijo RNA (deluje kot RNA šaperon) in rekrutira degredacijski kompleks (vsebuje Rnazo E), ki razgradi mRNA IL-10 ter s tem utiša njegovo izražanje<ref name="sedmi">N. De Lay, D. J. Schu, in S. Gottesman, „Bacterial Small RNA-based Negative Regulation: Hfq and Its Accomplices“, J. Biol. Chem., let. 288, št. 12, str. 7996–8003, mar. 2013</ref>. Ker sRNA za svojo aktivnost ne sme imeti dodatnih zaporedij, je skupina dodala še ribocim, ki povzroči cepitev sRNA s prvotne mRNA kontrukta<ref name="prvi" />. 

=== Inducibilno stikalo za uničenje ===

Zadnji element probiotične bakterije je inducibilno stikalo za uničenje, ki omogoča njeno uporabo v zdravljenju na biološko varni način (npr. ob primeru, da se pojavijo neželjeni učinki). Stikalo, ki ga je skupina dizajnirala je vsebovalo zapis za artilizin Art-175 (modificirani antimikrobni endolizin iz bakteriofagov<ref name="osmi">Part:BBa_K1659000, Prosto dostopno na: http://parts.igem.org/Part:BBa_K1659000 [28. 12. 2018]</ref>), zapis za oznako DsbA (sekrecija v periplazmo), oboje pod kontrolo inducibilnega tetraciklinskega promotorja pTet<ref name="prvi" /> . Po dodatku induktorja represorskega proteina TetR, se ta sprosti z promotorja, prepiše se zapis za artilizin, ki ko se izrazi, razgradi peptidoglikanski sloj in povzroči osmotsko lizo bakterije<ref name="četrti" />. Ker ta sistem deluje le v bakterijskih sevih z endogenim TetR, je skupina pripravila dvosmerni pTet, kjer je v eni smeri dodan še zapis za TetR brez tetraciklinskega operatorja<ref name="prvi" />. 

== Rezultati ==

Skupini ni uspelo v celoti karakterizirati naprave v predvidenem časovnem okvirju ampak samo nekaj posameznih elementov. Izmerili so odzivnost RNA-stikala na vrednost adenina, tako da so pred (kontrola) in za njegovim zapisom dali zapis za eCFP (angl. enhanched cyan fluorescent protein), in ugotovili, da se flourescenca povečuje z naraščanjem koncentracije adenina. Validirali so odločitev vključitve ribocima za utišanje izražanja s sRNA na primeru sfGFP (angl. superfolder GFP). Z uporabo človeškega  hammerhead ribocima so dosegli 75-odstotno zmanjšanje fluorescence sfGFP v primerjavi s kontrolo (sRNA brez ribocima). Karakterizirali so moč dvosmernega pTeT promotorja z merjenjem produkcije sfGFP in ugotovili, da je promotor odziven na induktor med 1 in 20 nM koncentracijo (nad to vrednostjo pride do nasičenja). Promotor pTet so nato uporabili pri karakterizaciji ubijalskega stikala, tako da so merili optično gostoto pri 600 nm v odvisnosti od koncentraciji induktorja. Bistveno je bilo spoznanje, da je puščanja promotorja dovolj nizko, da ne pride do neželene celične smrti, zato bo takšna bakterija lahko kolonizirala črevesje. Potrebno bo še poiskati drug induktor kot ATC z manjšim antibakterijskim delovanjem in večjo vezavno afiniteto, da se zmanjša vpliv na črevesni mikrobiom<ref name="prvi" />.

== Nadaljnji eksperimenti ==

Skupina priznava, da je projekt preobsežen, da bi ga lahko v dokončali v zastavljenem času. V prihodnosti bo potrebno natančneje karakterizirati posamezne elemente in nato celotno napravo. Optimizirati bo potrebno sproščanje Il-10: izbrati ustrezno hidrolazo (membransko/periplazemsko), sRNA in prilagoditi dolžino sRNA za optimalno utišanje izražanja IL-10. Napravo bi potem lahko testirali na biočipih (npr. z t. i. „gut on a chip“) in kasneje na živalskih modelih. Zadnja stopnjo predstavlja prenos sistema v Lactococcus lactis<ref name="prvi" />.

== Viri ==

<references/>