Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo

Uvod

Mikrobna biosinteza naravnih produktov ponuja prednosti pred ekstrakcijo biomase in kemične sinteze. Naravni gostitelj naravnih produktov, običajno rastline, rastejo počasi v različnih podnebjih in lahko pride do škodljivih variacij in do koncentracij produkta. Ekstrakcija biomase pogosto zahteva znatno več energije in več materiala za dosego zadostnega izkoristka produkta. Kemijska sinteza stremi k proizvajanju naravnih produktov. Potrebuje tudi veliko večjo količino energije medtem, ko proizvaja še toksične stranske produkte. Mikrobna biosinteza naravnih produktov nam pomaga, da se rešimo teh problemov. Biosintezna pot iz nativnih gostiteljev so presktrukturirali v vodljive platformne organizme, običajno E. coli ali S. Cerevisiae, katere nam služijo kot mikrobno celične tovarne. Mikrobi lahko porabljajo poceni vir ogljika, imajo kratki podvojevalni čas in proizvedejo visoko funkcionalni produkt z dodano vrednostjo in brez stranskih produktov. Mikrobna biosinteza je zelo primerna za produkcijo velikega števila naravnih produktov, vključujoč izoprenoide. Izoprenoidi so pomembni sekundarni metaboliti za zdravstveno industrijo. Sestavljeni so iz petih ogljikovih izoprenskih enot, ki se med seboj razlikujejo po cikliziranju in po preurejanju dodatnih skupin. Izoprenoidi, ki so jih včasih klicali tudi terpenoidi, imajo več kot 40000 unikatnih struktur. Terpenoidi so razvrščeni glede na njihovo število izoprenskih enot. Monoterpeni so iz dveh izoprenskih enot, seskuiterpeni (3 enote), diterpen (4 enote), triterpen (6 enot), karotenoidi ali tetraterpeni (8 enot). Pomembne spojine za zdravstveno industrijo lahko najdemo v veliko terpenoidnih razredih, vključno s karotenoidnim likopenom, seskuiterpena artemisinina, diterpena paklitaksela in triterpena 'domače' lekarne. Orodja sintetične biologije nam pomagajo povečati dostopnost izoprenoidov na trgu. Naravno biosintetično pot lahko enostavno prenesemo v industrijsko primernega gostitelja, kot sta E. coli in S. Cerevisiae. Končni titri željenega produkta bi postali dovolj visoki, da se doseže ekonomičnost. To dosežemo tako, da pot racionalno konstruiramo in optimiziramo. Razumni titri za komercialno produkcijsko skalo so trenutno neznanka. Pregledni članek kaže, da je 0,5 g/L ustrezna začetna točka za visoko vrednost spojine. Prvič je potrebno, da metabolna pot sintetizira želeni produkt. Drugič moramo izbrati primernega gostitelja za industrijsko produkcijo. Tretjič moramo prestrukturirati biosintetsko pot in gostitelja, da lahko operirata skupaj, nakar sledi optimizacija tako, da produkcija lahko postane komercialno relavantna. Te korake uporabljajo številne raziskovalne skupine za ustvarjanje biogoriv, blagovnih kemikalij in produktov zdravstvene industrije. Ta pregledni članek se fokusira na mikrobno proizvodnjo izoprenoidov za zdravstveno industrijo in napredovanje le te skozi sintetično biologijo. Štirje od desetih izoprenoidov o katerih bomo govorili se ali pa še bodo uporabljali v bližnji prihodnosti.

Težave

Primeri:

== Vgraditev kofaktorja je ključnega pomena holoencimsko aktivnost==

Indukcija sistema zorenja lahko poveča holoencimsko aktivnost, kot na primer karboksilne kislinske reduktaze (CAR), ki je bila pred kratkim uporabljena za proizvodnjo širokega spektra kemičnih proizvodov. CAR za svoje delovanje potrebuje kofaktor fosfopantetein. Ta kofaktor se med sintezo z encimom poveže preko fosfodiesterske vezi, kar omogoči encim zorenja, fosfopanteteinil transferaza. Ekspresija CAR v E. coli vodi k merljivim vendar izredno šibki aktivnosti. S soizražanjem fosfopanteteinil transferaze sfp iz Bacillus subtilis, se specifična aktivnost CAR za večkrat poveča v primerjavi z očiščenem encimom iz izvornega organizma. (5)

Poleg stimulacije specifične encimske aktivnosti lahko izboljšamo produkcijo holenmcimov tudi s povečanjem znotrajceličnega nivoja kofaktorjev, na kar sklepamo iz razmerja med Holo / apo-oblike ter stopnje degradacije. Ta pojav je bil pogosto opažen pri hemoproteinih. Z dodatkom δ-aminolevulinske kisline k mediju, se poveča tvorba hema zato se tudi stopnja izražanja hemoglobina ter citokroma b5 znatno izboljša. (6) Spodbujanje sinteze kofaktorja lahko poveča hitrost sinteznih poti

V zvezi z dejanskim vplivom, ki ga ima lahko inženiring kofaktorjev na metabolno uspešnost sinteznih poti je omenjena naslednja študija. Za proizvodnjo prekurzorja vitamina C, to je 2-keto-L-gulonske kisline, so uporabili dve dehidrogenazi, ki sta odvisni od PQQ in D-sorbitol kot izhodni substrat. Ugotovili so, da inducirana ekspresija dehidrogenaz ni izboljšala titra nad določenim pragom, in postavili hipotezo da je PQQ omejujoč dejavnik. Hipoteza se je izkazala za pravilno, saj je indukcija poti za sintezo PQQ povzročila za 20% povečanje celotnega titra. (7)

Zaključki

• Zaradi pomembnosti sinteze in integracije kofaktorjev za aktivnost holoencimov je potrebno upoštevati nekaj ključnih točk pri sestavljanju bioloških poti, ki vključujejo holoencime: 1. Aktivnost holoencima je mogoča le znotraj gostitelja, ki je metabolično sposoben sintetizirat potreben kofaktor, drugače je potrebno izvesti komplementarno pot za proizvodnjo kofaktorja. 2. Da zagotovimo maksimalno aktivnost holoencima mora biti apoencim sklopljen s sintezo in insercijo potrebnega kofaktorja. Neuravnoteženost med tema dvema vodi v slabo aktivnost encima, ki je nezadostna za katalitične procese. 3. Ker je znano da kofaktor izboljša stabilnost in aktivnost holoencimov, je verjetno da bo inženiring kofaktorjev uporabna metoda za izboljšanje celokupne aktivnosti vseh holoencimov znotraj inženirane poti in s tem k tvorbi produkta ki ga želimo. (1)

Viri:

1. Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways; Akhtar, Jones; 2014 2. Discovery of Two Novel Radical S-Adenosylmethionine Proteins Required for the Assembly of an Active [Fe] Hydrogenase; Posewitz; 2004 3. Pyrroloquinoline quinone biosynthesis in Escherichia coli through expression of the Gluconobacter oxydans pqqABCDE gene cluster; Yang; 2010 4. Genetic engineering of Escherichia coli for production of Tetrahydrobiopterin; Yamamoto; 2003 5. Reduction of Carboxylic Acids by Nocardia Aldehyde Oxidoreductase Requires a Phosphopantetheinylated Enzyme; Venkitasubramanian; 2006 6. Balanced globin protein expression and heme biosynthesis improve production of human hemoglobin in Saccharomyces cerevisiae; Liu; 2014 7. Stepwise metabolic engineering of Gluconobacter oxydans WSH-003 for the direct production of 2-keto-L-gulonic acid from D-sorbitol; Gao; 2014