Minicelice kot proizvodna platforma

Problem

Industrija je ena med večjimi onesnaževalci okolja. Tekstilna industrija je drugi največji porabnik vode in je odgovorna za 10% CO2 emisij v atmosferi [1]. Proteini pa so neprecenljiv resurs v industriji (tako tekstilni kot ostali) in proizvodnji. Encimi se uporabljajo za razne namene zato ker znatno zmanjšajo negativen vpliv številnih procesov na okolje, hkrati pa izboljšujejo donos, varnost in kakovost izdelkov. Zaradi vse večji potrebi po proteinov je podiplomska skupina iz Pariza na iGEM tekmovanju 2021 predstavila inovativen pristop k proizvodnji proteinov [2].

Cilj

Cilj te skupine je razviti v celoti novega načina za proizvodnjo proteinov s pomočjo tehnologijo minicelic. Projekt uporablja sistemski pristop k izboljšanju proizvodnje proteinov. Tako bi omogočili trajnostno in lokalno proizvodnjo, povečano odpornost proti sprememb v dobavni verigi, socialne blaginje ter varnost. Problem in cilj sta demonstrirana na primeru sinteze najpogostejšega barvila indigo [2].

Izvedba

Ideja je, da se zapis za željeni protein vstavi v plazmid, ta plazmid se pa transformira v sev E.coli, ki proizvaja minicelice. Minicelice lahko same sintetizirajo protein. Najprej je treba ločiti minicelice, ki proizvajajo protein od starševske E.coli, potem pa se sproži sinteza proteina, ki se ga na koncu očisti.

Podvojevanje E.coli je zagotovljeno s proteini Min in ftsZ

Proteini Min so inhibitorji polimerizacije proteinov ftsZ. ftsZ so proteini podobni tubulinom in sodelujejo pri celični delitvi tako, da najprej polimerizirajo okrog celice, potem s kontraktilnimi gibi preščipajo celico, da se ta razdeli na dve novi celici. Proteini Min se nahajajo v večini na polih bakterijske celice in vzpostavljajo koncentracijski gradient, ki ima najnižjo koncentracijo na sredini celice. Tako je inhibicija sestavljanja proteinov ftsZ najšibkejša v sredici bakterijske celice, kar pomeni, da bo na tem območju polimerizacija ftsZ največja. ftsZ proteini formirajo prstan okrog celice - prstan Z - ki manjša svoj premer tekom delitve, tako da na koncu delitve celico razdeli na dve novi. Polarna lokalizacija Min proteinov in polimerizacija ftsZ proteinov na sredini bakterijske celice sta dva ključna procesa, ki uravnavata podvojevanje bakterijske celice [3].

Minicelice

Min proteini omejujejo območje kje se lahko formira prstan Z (proteini ftsZ). Mutacija v zapisu za Min proteine (Min operon) pomeni odsotnost koncentracijskega gradienta in odsotnost signala za natančno lokalizacijo prstana Z. Posledično se ta prstan formira naključno vzdolž bakterijske celice kar privede do nesimetrično delitev celice. Ko celična delitev poteče bolj proti polih se odcepijo t.i. minicelice, ki vsebujejo ATP, ribozome in RNA polimeraze in druge stvari, vendar ne vsebujejo vedno kromosomsko DNA, ki je nujna za podvojevanje naprej. Obstajajo bakterijski sevi, ki proizvajajo minicielice, tako da imajo izbrisanega operona Min, nadomesti ga pa plazmid. Minicelice lahko vsebujejo enega ali več plazmidov ter lahko sintetizirajo proteine. Prednosti minicelic so, da ne rastejo in se ne podvojujejo, se ne štejejo kot živi organizmi, lahko odpravimo kontaminacijo (bakterijska celica se ne podvojuje, konstantno pa zgublja svoje resurse), zmanjšajo porabo energije [4].

Rezultati

Protizvodnja minicelic

Minicelice lahko proizvedemo na dva načina: z delecijo operona Min in z povečano ekspresijo ftsZ gena. So poiskusili oba pristopa, da ugotovijo kateri je boljši (v smislu dovolj dobre kontrole proizvodstva minicelic in donos proteina) ter seveda je tudi bil preiskan pristop s kombinacijo obeh omenjenih pristopov. Primerjali so mutante min (bakterije z delecijo operona min) in divji tip E.coli (K-12 MG1655). Naredili so dva seta konstruktov, katera na različna načina sprožijo proizvodstvo minicelic: eden induciran z IPTG, drugi induciran s povečanjem temperature. Povečanje temperature je problematično iz vidika čiščenja proteina, ki naj bi ga minicelice sintetizirale, saj korak čiščenje (kasneje omenjen) tudi vsebuje dvig temperature. Zato so se odločili da pri koraku proizvodnje izpustijo konstrukte inducirane s temperaturo in so uporabili samo tiste inducirane s IPTG.

Poiskusili so kombinacijo konstruktov z delecijo operona Min in povečane ekspresije gena ftsZ. V konstrukte so uporabili promotorja plac in represorja LacI (LacI se veže na plac operator in preprečuje izražanje; z dodatkom IPTG se sproži izražanje). V konstrukte so uporabili še promotorja ptet in represorja TetR (TetR se veže na ptet operator in preprečuje izražanja). Ta dva konstrukta (en z proteini Min, drug z protein ftsZ) naj bi dali v sevu z izbrisanega Min operona (že na voljo - TB43 sev posojen od iGEM Marburg 2015). V odsotnosti IPTG, Lacl se veže na plac in preprečuje izražanje tetR - takrat ni proizvodnje minicelic. Ko dodamo IPTG, se izraža TetR in preprečuje izražanje Min operona - minicelice se proizvajajo [5]. Karakterizacija je dala pozitivne rezultate.

Čiščenje minicelic

Ko imamo minicelice, naslednja stopnja je čiščenje oz. ločevanje minicelic od starševskih celic. To so naredili s pomočjo bakteriofagov. Profag je zapisan v genomu bakterije, zato se bodo lizirali samo bakterije, ki vsebujejo profag (ne minicelice). Sprememba iz lizogenega v litičnega cikla (s strani temperature ali reagenta) pomeni smrt za bakterijsko celico, se pravi, ostanejo samo minicelice, ki so metabolno aktivni (proizvajajo želeni protein). Zaradi podobnosti sestave membrane med bakterije in minicelice, nove fage lahko okužijo tudi minicelice (kar je slabo) - zato fagom so onemogočili nadaljno infekcijo z delecijo gena za terminazo A (gen za pakiranje DNA v kapsido). So uporabili seva E.coli z lambda profagom z izbrisanega gena za terminazo A - litični cikelj se sproži z dvigom temperature (saj se nahaja pod promotorjem cl857 občutljiv na temperaturo). Genom profaga so prestavili v svojega seva, ki proizvaja minicelice z tehnologijo P1 transdukcija. Karakterizacija je pokazala visoko učinkovitost.

Proizvodnja proteinov

Končni cilj tega projekta je proizvodnja želenega proteina - to so naredili z vključitvijo zapisa za želeni protein v plazmid, ki ga nato trasficiramo v E.coli, ki proizvaja minicelice, z namenom, da te minicelice naprej proizvajajo končen protein. Zapis za željeni protein se vstavi v pUC19 plazmid pod kontrolo pBad promotorja in araC proteina, indukcija pa poteka z arabinozo. V odsotnosti arabinoye se araC veže na pBad operator in preprečuje izražanje proteina. Ko dodamo arabinozo se aktivira promotor in se sproži prepisovanje željenega gena. Za dodatno robustnost, gen za araC se tudi nahaja na plazmidu pod kontrolo pC promotorja. Karakterizacija je pokazala da je Golden Gate assembly najbiljši pristop.

Uporaba v industriji

Projekt je usmerjen v industrijo in poskuša predstaviti nov način proizvodnje. Kot primer, da koncept dejansko deluje, so izbrali sintezo barvila indigo, ki se v tekstilni industriji veliko uporablja. Za proizvodnjo tega barvila so potrebni številne kemijske spojine in zapletena organska sinteza. Skupina je poskusila barvilo sintetizirati na sintezno-biološki način. Najprej so uporabili plazmid, ki vsebuje plazmid za encim trimetilamin monooksigenaza (tmm). Ta plazmid so transformirali v divji tip E.coli. Encim katalizira pretvorbo indola v indoksila. Indol je naraven produkt metabolizma triptofana v E.coli [6]. Indoksil se oksidira v zraku do barvila indigo. Barvilo je nato očiščeno. Za dokaz da koncept deluje so pripravili dva plazmida. S pomočjo metode CPEC so klonirali gen tmm v dveh plazmidih (pBAD-pR in pST000). pBAD-pR plazmid vsebuje celega arabinoznega operona (AraC, pC in pBAD promotor). pTS000 vsebuje samo arabinoznega promotorja. Ob dodatku L-arabinoze, naj bi se sprožila sinteza indiga. Na gojišču kjer so gojili transformirane E.coli so zaznali temnejšo barvo kolonij. Verjeli so, da se gre za prisotnost indoksila.

Viri

[1] Niinimäki, K., Peters, G., Dahlbo, H. et al. The environmental price of fast fashion. Nat Rev Earth Environ 1, 189–200 (2020). https://doi.org/10.1038/s43017-020-0039-9

[2] https://2021.igem.org/Team:Paris_Bettencourt/Description)

[3] Rowlett VW, Margolin W. The bacterial Min system. Curr Biol. 2013;23(13):R553-R556. doi:10.1016/j.cub.2013.05.024

[4] Farley, M. M., Hu, B., Margolin, W., & Liu, J. (2016). Minicells, Back in Fashion. Journal of Bacteriology, 198(8), 1186–1195. https://doi.org/10.1128/jb.00901-15

[5] Bi, E., & Lutkenhaus, J. (1990). Interaction between the min locus and ftsZ. Journal of Bacteriology, 172(10), 5610–5616. https://doi.org/10.1128/jb.172.10.5610-5616.1990

[6] http://parts.igem.org/Part:BBa_K1403015