Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi C. reinhardtii: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
(New page: <h2>Uvod</h2> Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bo...)
 
No edit summary
Line 1: Line 1:
<h2>Uvod</h2>
<h2>Uvod</h2>
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni.
Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga ''Chlamydomonas reinhardtii'' je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote ''Chlamydomonas'' primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni.
Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije »Golden Gate«, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4.  Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom ''Chlamydomonas''.
<h2>Standard in vsebina kompleta MoClo<h2/>
Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2.
V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za ''Chlamydomonas'', a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti ''BpiI'' in ''BsaI'' odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne.
Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, ''aadA'', s konstitutivnimi promotorji P<sub>PSAD>sub> in P<sub>βTUB2<sub> z ali brez prvega introna ''βTUB2''. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM35 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna ''βTUB2'' je močno povečala učinkovitost transformacije.

Revision as of 15:50, 3 April 2020

Uvod

Zaradi zmanjševanja zalog fosilnih goriv in zaradi toplogrednih plinov, ki se kopičijo kot posledica njihove porabe, postaja razogljičenje svetovnega gospodarstva vedno bolj nujno. Ena od možnosti je uporaba fotosintetskih mikroorganizmov, kot npr. mikroalge za potencialno sintezo prekurzorjev biogoriva iz atmosferskega ogljikovega dioksida v procesu, za katerega bi porabljale sončno energijo. Zelena mikroalga Chlamydomonas reinhardtii je vrsta, ki se pogosto uporablja v biotehnologiji in bioinženiringu, saj je so vsi njeni genomi (jedrni in organelni) že posekvencirani in anotirani, molekularnobiološke tehnike in pogoji za gojenje v kulturi so visoko razviti, njena fiziologija in metabolizem pa sta dobro raziskana. Deli, razviti za MoClo se lahko uporabljajo tudi v številnih drugih vrstah mikroalg, saj so transkripcijske enote Chlamydomonas primerne za številne gostitelje, med katerimi so nekateri tudi industrijsko pomembni.

Organizme je enostavneje bioinženirsko modificirati z uporabo in sestavljanjem standardiziranih delov, saj to olajša gradnjo sintetičnih molekul DNA. Med razpoložljivimi standardi je MoClo tehnologija, ki obstaja od leta 2011 in je hierarhična nadgradnja molekulske klonirne tehnologije »Golden Gate«, osnovane na restrikcijskih encimih tipa IIS in DNA ligazi T4. Bazira na tvorbi standardizirane knjižnice osnovnih biokock, ki jih modificira tako, da se čimbolj prilegajo gostitelju in se jih združuje v višje enote v želenem vrstnem redu. MoClo kompleti so bili predhodno že razviti za številne modelne organizme, a ne še za mikroalge. Orodni komplet MoClo, predstavljen v članku, je sestavljen iz več kot 100 genetskih delov, ki so kodonsko optimizirani za jedrni genom Chlamydomonas.

Standard in vsebina kompleta MoClo

Sintaksa kompleta je definirana za plazmide najnižje stopnje, 0, ki vsebujejo standardne genetske dele (module stopnje 0) in jim pripisujejo fuzijska mesta za 10 klonirnih pozicij. V enem koraku lahko te standardizirane dele združimo v samostojne transkripcijske enote, module stopnje 1 in večgenske konstrukte, ki so stopnje 2. V članku predstavljen komplet MoClo je sestavljen iz 119 delov, ki vključujejo 67 standardnih genetskih elementov, ki so na voljo na različnih mestih znotraj standarda. Večina standardnih genetskih elementov v kompletu je bilo razvitih za Chlamydomonas, a so jih avtorji članka dodatno modificirali tako, da so restrikcijski mesti BpiI in BsaI odstranili iz genoma z uporabo DNA sinteze ali mutageneze s PCR (vedno se ju znebimo na ničti ravni kloniranja). Genetski deli, ki so na voljo, zajemajo 7 promotorjev, ki so lahko s svojimi genetskimi elementi sklopljeni ali pa ne. Prva raven kloniranja je združevanje modulov v transkripcijsko enoto. Kot selekcijske markerje so uporabili pet genov za rezistenco na antibiotik, ki lahko funkcionirajo tudi kot reporterski geni. V raziskavi, opisani v članku, so združili module, ki omogočajo kontrolo ekspresije gena za rezistenco na spektinomicin, aadA, s konstitutivnimi promotorji PPSAD>sub> in PβTUB2 z ali brez prvega introna βTUB2. Učinkovitost transformacije treh modulov v celicah UVM35 je bila ocenjena s štetjem kolonij, ki so zrasle na gojišču s streptomicinom. Prisotnost introna βTUB2 je močno povečala učinkovitost transformacije.