Način pakiranja RNA pri koronavirusih

Uvod

Zaradi pomanjkanja ustreznih celičnih mehanizmov, so virusi omejeni na razmnoževanje znotraj gostiteljske celice. Za uspešno oblikovanje in izstop viriona iz okužene celice je izjemnega pomena ustrezno kompaktiranje dedne snovi. Mehanizem slednjega pri mnogih virusih, med njimi tudi pri družini koronavirusov, sloni na inkorporaciji signalov za pakiranje (PS) v obliki cis regulatornih elementov (iz agl. “cis-acting RNA”, CRE). Ti omogočajo prepoznavo in povezavo z drugimi makromolekulami, tudi proteini, ki posredujejo pri pakiranju dednega zapisa. V primeru koronavirusov torej genomske RNA (gRNA). Štirje najpomembnejši proteini koronavirusnega viriona so: protein bodice (S), ki sodeluje pri prepoznavi in vstopu v gostiteljsko celico, pri brstenju viriona sta odločilna membranski protein (M) in protein ovojnice (E). Nukleokapsido, skupaj z gRNA, oblikuje nukleokapsidni protein (N) [1].

Signali za pakiranje

Taksonomsko koronaviruse delimo v štiri rodove: alfa-, beta- (filogenetske linije A, B, C in D), gama- in deltakoronaviruse. Osnovo za raziskave pakiranja RNA predstavlja linija A betakoronavirusov, ki je nato omogočila tudi vpogled v PS pri ostalih rodovih. Čeprav je sama lokacija PS razmeroma dobro ohranjena, vseeno prihaja do mnogih sprememb tako med rodovi kot filogenetskimi linijami. Virus mišjega hepatitisa (MHV) umeščamo med betakoronaviruse linije A. Na podlagi njegovega genomskega zaporedja so razpoznali PS kot 190 nukleotidov dolg segment na 3’ koncu bralnega okvirja 1b (ORF1b). Ta se nahaja približno 20 kb od 5’ konca gRNA in zapisuje encim replikaza-transkriptaza. Sam signal najdemo na delu nsp15 imenovanega encima in tvori značilno zanko. Pri MHV in nekaterih drugih virusih linije A (primer goveji koronavirus (BCoV)) zanka vsebuje štiri ponovitve motiva ACG/GUAAU z AA ali GA izboklino na 3’ strani v enakomernih prekinitvah. Zanko na podobnem mestu, a z drugačnim nukleotidnim zaporedjem – zanka bogata z U nukleotidi - najdemo tudi pri virusih SARS-CoV (betakoronavirus linija B) in MERS-CoV (betakoronavirus linija C). Pri slednjih zanko, ki se prav tako nahaja blizu 3’ konca ORF1b, označujemo s SL2. Glede na analogijo njene pozicije in nenazadnje tudi podobnost v obliki ter ohranjenost znotraj rodu lahko sklepamo, da SL2 predstavlja centralni PS tudi pri linijah B in C betakoronavirusov [1,2] Glede na do sedaj pridobljene podatke se PS alfakoronavirusov nahaja skoraj na samem 5’ koncu gRNA. Ne glede na razlike med posameznimi sevi tega rodu, lahko PS umestimo na predel gena nsp1, kjer se tvori več zank z značilnimi ponovitvami GGG, ki so najverjetneje odločilne za ustrezno prepoznavanje N proteina [1,3]. Spekulativno možnost za PS predstavlja mesto zelo blizu 5’ konca gRNA (prav tako predel gena nsp1), ki tvori obliko zanke (SL5) z dodatno razvejenim vrhom. Pri alfakoronavirusih slednje vsebujejo ponovitve motiva UUYCGU, linije B, C in D betakoronavirusov iteracije motiva UUUCGU. Ohranjenost SL5 med rodovi nakazuje na pomembno vlogo v življenjskem ciklu koronavirusov, glede na ponovitve motiva tudi možnost za PS [1,2]. Gama- in deltakoronavirusi ne vsebujejo nobene oblike insercij SL5, torej imajo pakirna zaporedja na drugih delih gRNA. Zaradi težav z in vitro vzgojo virusov teh rodov, natančno mesto PS ni znano pri nobenem. Domnevni PS segment deltakoronavirusov je 104 nukleotidov dolg vključek pri zapisu za replikazo na ORF1b (področje genov nsp13 in nsp14) [1].

Vloga signala za pakiranje v virusnem genomu

Koronavirusni PS je cis-regulatorni element, ki se nahaja le na gRNA in omogoča selektivno ločevanje gRNA od ostale subgenomske RNA (sgRNA) in celične mRNA ter tako pakiranje v nov virus. Mutanti virusa, pri katerih je bila porušena sekundarna struktura PS RNA (silPS) ali je bil PS v celoti odstranjen, so poleg gRNA zapakirali velike količine sgRNA [4]. Presenetljivo je bil betakoronavirus MHV kot mutant brez PS (na katerem so potekali testi) vseeno popolnoma sposoben preživeti. Pokazale so se zgolj majhne ali nobene razlike, glede na divji tip, v velikosti oblog, morfologiji in kinetiki rasti [1]. To je zelo zanimivo, saj so enaki testi tokrat z mutantom alfavirusa (brez PS) pokazali enake rezultate (povečana količina sgRNA v virusu), a hkrati zelo različne. PS-negativni alfavirusni mutanti so imeli veliko resnejše rastne defekte fenotipa, kar je verjetno posledica omejene količine RNA, ki jo lahko sprejme ikozaedrična kapsula [1]. Poskusi s MHV-JHM virusom so pokazali, da so bili mutanti brez PS manj smrtonosni in hitreje ozdravljivi kot divji tip. Domneva se, da že majhna količina neg. sgRNA, ki se zapakira poleg gRNA lahko inducira IFN-I kar vodi v imunski odziv [5]. Izkaže se tudi, da če morata mutant in divji tip virusa tekmovati za gostitelje se je, ne glede na začetno razmerje med virusoma, divji tip hitreje širil. Rezultati teh raziskav so pokazali, da imajo virusi s PS prednost v tem, da je njihov fitnes večji in so težje zaznavni za imunski sistem ter PS ni nujno potreben, da se RNA pakiranje izvede. Raziskave so tudi pokazale, da dokler s svojo prisotnostjo PS ne vpliva na delovanje proteinov, lega PS na gRNA ni pomembna, pomembna je le njegova prisotnost.

Prepoznava signala za pakiranje: M protein

Rezultati mnogih raziskav se strinjajo, da se lahko tako M kot N protein vežeta na PS na gRNA. Oba imata pomembno vlogo pri pakiranju gRNA in med seboj samo ob prisotnosti PS tudi interagirata. Do nesoglasja pride pri vprašanju, kateri od teh proteinov je odgovoren za specifično vezavo PS. M protein (30 kDa) sestavlja majhna ektodomena, tri transmembranske domene in velika endodomena preko katere interagira z N proteinom [1]. Glede na z raziskavami pridobljene podatke, da se N protein bolj ali manj enakovredno veže na ves RNA (virusni in celični) medtem, ko naj bi se M protein specifično vezal le na PS. To je zanimivo, saj so še do pred kratkim menili, da se N protein specifično veže na PS. Raziskave so pokazale tudi, da so MHV virusi brez M proteina kljub prisotnosti PS zapakirali velike količine ne-virusne RNA. Dokazano je bilo, da se je ne-virusna RNA s PS uspešno zapakirala v VLP (ang. »virus like particle«) tudi ob odsotnosti N proteina. Ti rezultati močno kažejo, da je protein M (po možnosti s pomočjo E proteina) virusna komponenta, ki prepozna in se veže na PS, ter da formacija nukleokapsid z N proteinom za specifičnost ni pomembna [1].

Vloga domen CTD in N3 proteina N v prepoznavanju PS

Protein N (50 kDa) je tisti, ki ovije genomsko RNA v helikalni nukleokapsid in vsebuje dve zelo bazični domeni: CTD (C-terminalna domena) ter NTD (N-terminalna domena). Domeni sta med seboj ločeni in imata vsaka popolnoma lastno zvitje. Na C-terminalnem koncu proteina je prisotna še kisla domena N3, preko katere pride do nastanka kompleksa z endodomeno proteina M. Funkcionalna enota proteina N je sicer tudi dimer, ki nastane preko dimerizacijske domene CTD. Zgoraj omenjene domene povezujejo presledkovni segmenti, ki so, tako kot tudi domena N3, strukturno neurejeni polipeptidi. CTD in NTD proteina N sta oba RNA-vezavni domeni. Sama prisotnost dveh takih domen je dokaj nenavaden pojav za nukleokapsidni protein RNA virusa. Bila je zato izvedena genetska raziskava na virusu MHV za določitev njunega funkcionalnega pomena, kjer sta bile ti domeni substituirani s svojimi analogi iz virusa SARS-CoV. Homolognost med virusoma (44% identičnost za NTD in 35% za CTD) je omogočila izvedljivost tega eksperimenta, hkrati pa je bilo možno določiti zaporedno-specifične interakcije med proteinom N in drugimi virusnimi komponentami. Izkazalo se je, da je substitucija domene CTD precej oslabilo selektivnost pakiranja (podobno kot pri mutantu silPS) ne glede na prisotnost PS divjega tipa. Ugotovitev, da je CTD tista domena, ki prepozna PS, ni v skladu s strukturnimi podatki obeh domen, saj NTD vsebuje, poleg bazičnih, tudi aromatske ostanke, ki naj bi lahko prepoznali oziroma tvorili specifične interakcije z določenimi bazami na gRNA. Prav tako je bil odkrit segment dolg devet aminokislinskih ostankov v domeni N3, katerega prisotnost (ali ohranjenost) je določilo delovanje pakiranja [1].

Modeli mehanizma pakiranja

Raziskave na osnovi MHV so torej dokazale ključno vlogo v prepoznavanju PS za N kot za M protein. Dvoumnost rezultatov izmed večjih virov zato mogoče namiguje na to, da je kombinacija obeh ključna za pakiranje pravilne RNA (gRNA) v virione. Trenutno so se uveljavili trije modeli, ki opisujejo mehanizem pakiranja: prvi predpostavi primarno prepoznavanje PS iz strani CTD domene proteina N, ki naj bi po vezavi PS sprostila prej asocirano domeno N3 - sledila bi vezava N3 na endodomeno proteina M. Tak mehanizem bi torej v proces pakiranja vključil samo tiste molekule RNA, ki vsebujejo PS. Drugi model pa kot začetno interakcijo predlaga vezavo PS na endodomeno proteina M, kjer bi nato sledilo rekrutiranje domen N3. Interakcija protein M-PS bi predstavljala nukleacijsko točko za nastanek vseh sledečih interakcij, ki vodijo do brstenja virionov. Medtem ko zadnji model predpostavi, da je prepoznavanje PS možna le takrat, ko sta proteina N in M že med seboj vezana v kompleksu. Ena izmed možnih interpretacij predlaga, da interakcija z M povzroči konformacijske spremembe v N, ki bi izoblikovale vezavno mesto za PS. Sama, torej, ne moreta prepoznati signala za pakiranje [1].

Viri

1. Masters, P. S. Coronavirus genomic RNA packaging. Virology 537, 198–207 (2019).
2. Alhatlani, B. Y. In silico identification of conserved cis-acting RNA elements in the SARS-CoV-2 genome. bioRxiv 15, 409–417 (2020).
3. Kim, D. Y., Firth, A. E., Atasheva, S., Frolova, E. I. & Frolov, I. Conservation of a Packaging Signal and the Viral Genome RNA Packaging Mechanism in Alphavirus Evolution. J. Virol. 85, 8022–8036 (2011).
4. Kuo, L. & Masters, P. S. Functional Analysis of the Murine Coronavirus Genomic RNA Packaging Signal. J. Virol. 87, 5182–5192 (2013).
5. Athmer, J. et al. Selective packaging in murine coronavirus promotes virulence by limiting type I interferon responses. MBio 9, 1–12 (2018).