Napredki v načrtovanju bioloških logičnih vrat v živih celicah

From Wiki FKKT

Revision as of 20:57, 3 January 2016 by MonikaBiasizzo (Talk | contribs)
(diff) ←Older revision | Current revision (diff) | Newer revision→ (diff)
Jump to: navigation, search

Contents

Uvod

Eno izmed področij sintezne biologije predstavljajo biološka vezja, pri katerih nas želimo razumeti biološke mehanizme logičnih vrat, izboljšati hitrost vezij in jih vključiti v biotehnološke aplikacije. V elektroniki so logična vrata fizične naprave, ki izvajajo Booleanske funkcije na vhodnih signalih in jih pretvorijo v izhodne signale. Biološka logična vrata predstavljajo makromolekule v celici, ki z medsebojnimi interakcijami uravnavajo stanje prepisovanja določenega gena, med vključenim in izključenim (ON in OFF) stanjem. Koncentracija produkta tega gena, RNA ali proteina, predstavlja vhodni ali izhodni signal logičnih vrat. Sestavni elementi bioloških logičnih vratih so kodirajoča DNA, promotorji, transkripcijski faktorji, RNA polimeraza, nekodirajoča RNA, DNA vezavni elementi in male signalne molekule.[1].

Biološka logična vrata v bakterijah

IN (AND) in NE-IN (NAND) logična vrata

Pri IN logičnih vratih je izhodni signal visok, samo kadar sta oba vhodna signala visoka. Logična vrata so lahko sestavljena iz 2, 3, 4 ali več vhodnih signalov. Najpreprostejša so logična vrat z dvema vhodnima signaloma. Primer takih logičnih vrat sestavljata dva inducibilna promotorja kot vhodni signal in en T7 promotor kot izhodni signal. Vhodni signal je lahko mala molekula, ki povzroči aktivacijo ali sprosti represijo inducibilnega promotorja. Ob aktivaciji obeh vhodnih promotorjev se aktivira tudi izhodni promotor, katerega produkt zaznamo kot izhodni signal. Prvi vhodni promotor kontrolira izražanje T7 RNA polimeraze z dvema internima jantarnima stop kodonoma. V bakterijskem sevu, ki nima zapisa za jantarski supresor tRNA supD je prevajanje mRNA ustavi pri jantarnem kodonu in ne nastane funkcionalna T7 RNA polimeraza. Zato prepisovanje jantarskega supresorja tRNA supD vstavimo pod kontrolo drugega vhodnega promotorja. Tako od aktivaciji obeh vhodnih promotorjev z vhodnim signalom dobimo jantarski supresor tRNA supD, ki omogoči prevajanje mRNA do celotne funkcionalne T7 RNA polimeraze. Nastala T7 RNA polimeraza se veže na izhodni T7 promotor in prepisuje gen za reporterski protein, ki ga lahko zaznamo kot izhodni signal. Če en izmed vhodnih signalov ni prisoten, ne nastane funkcionalna T7 RNA polimeraza in reporterski protein se ne izraža. Bolj zapletena IN logična vrata vključujejo 3, 4 ali več vhodnih signalov. Za izvedbo logičnih vrat s tremi ali štirimi vhodnimi signali lahko sestavimo več logičnih vrat z dvema vhodnima signaloma zaporedno in s tem dosežemo učinek IN logičnih vrat z več vhodnimi signali. [1][2]

NE-IN logična vrata so vrata, ki povezujejo izhodni signal IN logičnih vrat z NE vrati. Sestavimo jih lahko iz IN logičnih vrat, ki jih sledijo NE vrata.Pri NE-IN logičnih vratih je izhodni signal visok, kadar je katerikoli izmed vhodnih signalov nizek. Izhodni signal iz IN logičnih vrat je povezan z NE vrati, najpogosteje kot represor promotorja, ki kontrolira izražanje reporterskega proteina. Najpogosteje uporabljeni regulatorji izražanja so LacI, TetR in λCI (termolabilna oblika), ki delujejo kot represorji za njim ustrezne promotorje (Plac, Ptet in PR promotor). Vhodni signali, ki te promotorje aktivirajo oziroma sprostijo njihovo represijo so male molekule IPTG in aTc in povišana temperatura. NE-IN logična vrata so ključnega pomena pri razvijanju spomina sistema in s tem za razvoj dolgoročnega spomina. Združeni logični in spominski sistemi bi omogočali razvoj kompleksnih bioloških naprav z določenim obnašanjem, ki bi bile uporabne v terapevtske in diagnostične namene. [1][3]

NE-ALI (NOR) in izključujoča ALI (XOR) vrata

Tako NE-ALI in izključujoča ALI logična vrata so vrata, ki imajo točno dva vhodna signala in en izhodni signal. NE-ALI logična vrata so enakovredna zaporedno povezanim ALI in NE logičnim vratom. Izhodni signal NE-ALI vrat je nizek, kadar je katerikoli izmed vhodnih signalov visok. Prav tako kot pri NE-IN vratih, lahko tudi NE-ALI vrata sestavimo iz ALI in NE vrat, ki so zaporedno povezana. Enostavna ALI vrata lahko sestavimo iz dvem zaporednih inducibilnih promotorjev, obrnjenih v isto smer, ki ju lahko aktivirata vhodna signala. Izhodni signal je količina nastalega produkta, ki je pod kontrolo teh dveh promotorjev. Pri NE-ALI vratih je izhodni signal ALI vrat represor promotorja za reporterski protein. Tako se reporterski protein izraža samo, kadar sta oba vhodna signala nizka in ne sprožita izražanja represorja. Primer NE-ALI vrat so sestavili iz Pbad in Ptet promotorjev zaporedno, ki sta uravnavala prepisovanje represorja CI. Na drugem plazmidu je bil zapis za reporterski protein YFP pod kontrolo Pr promotorja, katerega delovanje uravnava represor CI. Ob dodatku enega izmed vhodnih signalov, Ara ali aTc, pride do prepisovanje represorja CI in s tem je izražanje reporterskega proteina zavrto. Ko sta oba vhodna signala odsotna, represije ni in lahko zaznamo sintetiziran reporterski protein. [1][4]

Izključujoča ALI ali XOR vrata dajo visok izhodni signal samo kadar je en vhodni signal visok in drugi nizek. XOR vrata lahko sestavimo s kombinacijo treh NE-ALI logičnih vrat. V ta namen so pripravili štiri različne bakterijske seve z različnimi logičnimi vrati. Prvi trije sevi vsebujejo NE-ALI vrata, četrti sev pa vsebuje vrata, ki združuje signal in drugega in tretjega seva. Vhodna signala za prvi sev sta Ara in aTc, ki aktivirata Pbad in Ptet promotorja. Izhodni signal prvega seva je protein LasI, ki je ključen za sintezo 3OC12-HLS in je prvi vhodni signal za drugi in tretji sev. Drugi signal je Ara (drugi sev) oziroma aTc (tretji sev). Izhodni signal v drugem in tretjem sevu je protein RhII, ki sintetizira C4-HSL, ki ga zazna četrti sev. Četrti sev združi signala in drugega in tretjega seva , tako da ob prisotnosti C4-HSL sproži sintezo reporterskega proteina. Za uspešen prenos signalov med sevi morajo biti njihove kolonije razporejene na plošči dovolj blizu in v pravilni orientaciji. [1][4]

Biološka logična vrata v kvasovkah

Kvasovka S. cerevisiae je pomemben modelni organizem, ki ga pogosto uporabljajo v biotehnoloških procesih, kot so proizvodnja alkoholnih pijač, biogoriv in kemikalij. Zaradi svoje uporabnosti je tudi eden izmed tarčnih organizmov za uvajanje logičnih vrat, za natančnejšo regulacijo celičnih procesov. V kvasovkah so uspeli pripraviti večino enostavnejših logičnih vrat, kot so IN, ALI, NE-IN, NE-ALI, izključujoč ALI in druga logična vrata. Vsa logična vrata so načrtovali z več različnimi sevi, ki se odzivajo na zunanje signale in med seboj komunicirajo. Reporterski protein je bil v vseh sevih pod kontrolo fus1 promotorja in so ga lahko zaznavali s fluorescenco (npr. GFP). [1][5]

Pri IN logičnih vratih so uporabili dva različna seva, ki se odzivata na zunanje signale. Prvi sev se odziva na prisotnost NaCl, ki povzroči sintezo fermona, ki ga zaznava drugi sev. Poleg fermona zaznava drugi sev tudi zunajcelični estradiol in v prisotnosti obeh signalov (NaCl oziroma fermona in estradiola) sproži nastanek in aktivacijo Fus3 kinaze, ki sproži izražanje reporterskega proteina preko fus1 promotorja. Podobno so sestavljena NE-ALI logična vrata, pri katerih so prav tako uporabili dva različna seva, ki se odzivata na zunanja signala doksiciklin in 6a inhibitor Fus3 kinaze ter fermon, ki ga sprošča prvi sev. Samo ob odsotnosti obeh vhodnih signalov je prisoten reporterski protein oziroma izhodni signal. [1][5]

ALI logična vrata so sestavili iz treh različnih sevov z dvema vhodnima signaloma NaCl in galaktozo. Prvi in drugi sev se odzivata na prisotnost enega od vhodnih signalov preko sproščanja fermona. Tretji sev se odziva na prisotnost fermona in sproti sintezo reporterskega proteina. Za sintezo reporterskega proteina zadostuje sproščanje fermona iz enega izmed prvih dveh sevov, kar odraža delovanje ALI logičnih vrat. Podobno so sestavili NE-IN logična vrata z vhodnima signaloma doksiciklin in glukozo. Prvi in drugi sev se odzivata na posamezna vhodna signala in sproščata ferom samo v odsotnosti vhodnega signala. Tretji sev v prisotnost fermona sintetizita reporterski protein. Kadar sta prisotna oba signala, se fermon ne sprošča in ni izražanja reporterskega proteina oziroma izhodnega signala. Tak način sestavljanja različnih sevov in vzpostavljanja komunikacije med njimi omogoča sestavljanje zapletenih logičnih operacij brez zapletenih posegov v celične sisteme. [1][5]

Biološka logična vrata v sesalskih celicah

Sesalske celice so za sintezno biologijo in načrtovanje bioloških logičnih vrat velik izziv, saj ne poznamo dovolj heterolognih elementov za kontrolo trasnkripcije, ki so kompatibilni s sesalskimi celicami. Zaradi pomanjkanja teh ključnih elementov je načrtovanje bioloških logičnih vrat v sesalskih celicah bistveno težji kot v bakterijah in kvasovkah. Poleg tega je problematičen tudi vnos večkomponentnega sistema logičnih vrat v sesalske celice in ustvarjanje stabilne celične linije. Kljub vsem oviram so že uspeli sestaviti nekatera biološka vrata v sesalskih celicah, kot so IN, ALI, NE-IN, NE-ALI in druga. Razvoj bioloških logičnih vrat v sesalskih celicah bi lahko ključno prispeval k razvoju novih terapevtskih in diagnostičnih aplikacij. [1][6]

Zaključek

Načrtovanje bioloških logičnih vrat je v zadnjem desetletju napredovalo do uporabe logičnih vrat v bakterijskih celicah, kvasovkah in sesalskih celicah. V nekaterih primerih so uspeli že sestaviti bolj kompleksna logična vezja, ki vsebujejo več bioloških logičnih vrat povezanih med seboj in jih že vključili v nekatere aplikacije. Bolj zapleteni sistemi zahtevajo tudi komunikacijamo med celicami za prenos in združevanje signalov. Največji problem bioloških logičnih vrat je poleg kompleksnosti tudi čas, ki je potreben za samo izvajanje logične operacije. V primerjavi z elektronskimi logičnimi vrat je ta bistveno daljši, saj temelji na prepisovanju in prevajanju, ki sta relativno počasna procesa v živih sistemih. [1][5][6]

Razvoj bioloških logičnih vrat je ključen korak za ustvarjanje bioloških vezij in razvoj bioračunalnikov. Programiranje živih sistemov v biotehnologiji omogoča izboljšanje obstoječih celičnih procesov in razvoj novih aplikacij. Dolgoročni cilj načrtovanja sintetičnih logičnih vrat so genska vezja s sposobnostjo sprejemanja odločitev, ki jih lahko po želji reprogramiramo. Takšne sisteme bi lahko uporabili za oster nadzor celičnih funkcij v vodenih biotehnoloških aplikacijah, saj lahko dosežemo odzivanje mikroorganizmov na pogoje v sistemu. Prav tako lahko z umetnimi logičnimi operacijami ustvarimo nove aplikacije na področju diagnostike in terapije. [1][5][6]

Viri

  1. 1.00 1.01 1.02 1.03 1.04 1.05 1.06 1.07 1.08 1.09 1.10 V. Singh, “Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells.,” Syst. Synth. Biol., vol. 8, no. 4, pp. 271–82, Dec. 2014.
  2. J. C. Anderson, C. A. Voigt, and A. P. Arkin, “Environmental signal integration by a modular AND gate.,” Mol. Syst. Biol., vol. 3, p. 133, Jan. 2007.
  3. C. C. Guet, M. B. Elowitz, W. Hsing, and S. Leibler, “Combinatorial synthesis of genetic networks.,” Science, vol. 296, no. 5572, pp. 1466–70, May 2002.
  4. 4.0 4.1 A. Tamsir, J. J. Tabor, and C. A. Voigt, “Robust multicellular computing using genetically encoded NOR gates and chemical ‘wires’.,” Nature, vol. 469, no. 7329, pp. 212–5, Jan. 2011.
  5. 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 S. Regot, J. Macia, N. Conde, K. Furukawa, J. Kjellén, T. Peeters, S. Hohmann, E. de Nadal, F. Posas, and R. Solé, “Distributed biological computation with multicellular engineered networks.,” Nature, vol. 469, no. 7329, pp. 207–11, Jan. 2011.
  6. 6.0 6.1 6.2 B. P. Kramer, C. Fischer, and M. Fussenegger, “BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells.,” Biotechnol. Bioeng., vol. 87, no. 4, pp. 478–84, Aug. 2004.
Personal tools