View source for Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja

Povzeto po raziskovalnem članku: D. Nevozhay, R. M. Adams, K. F. Murphy, K. Josić, G. Balazsi. »Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression.« PNAS 2009, let. 106, št. 13, str. 5123-5128. [https://www.pnas.org/content/106/13/5123]

== Uvod ==
Celice z istim genomom lahko zaradi naključnih dogodkov, kot sta celična delitev ali različni celični odzivi na okolje, vsebujejo različne koncentracije proteinov. Ta heterogenost je znana kot šum genskega izražanja. Ker so skoraj vsi geni del transkripcijskih mrež, je njihovo izražanje odvisno od prisotne regulacije. Tako je pogosto prisotna negativna povratna zanka, ki zmanjša šum genskega izražanja, inducira oscilirajoče gensko izražanje in zmanjša porabo energije za sintezo proteinov z zaviranjem sinteze mRNA. Znano je, da negativna povratna zanka vpliva na krivuljo odziva, vendar ni bilo izvedenih natančnejših študij. Zato je bil namen raziskave, določiti vpliv negativne povratne zanke na gensko izražanje v sintetičnih transkripcijskih kaskadah. Za poskuse so v kromosome haploidnega seva kvasovke ''S. cerevisiae'' YPH500 integrirali vezje iz regulatornega in reporterskega dela s pomočjo integracijskega plazmida pRS4D1 ter s tekočinsko citometrijo merili odzive na induktor [1].

== Transkripcijska kaskada brez samoregulacije ==
V kromosome ''S. cerevisiae'' so vgradili vezje z negativno regulacijo, sestavljeno iz regulatornega in reporterskega dela. Regulatorni del sta sestavljala tetraciklinski represor TetR in konstitutivni promotor PGAL1 v prisotnosti galaktoze [1,2]. Kot induktor so uporabili anhidrotetraciklin (ATc), ki se veže na represor TetR in mu prepreči vezavo na tarčni promotor, kar omogoči izražanje ustreznega gena. Reporterski del sta sestavljala promotor PGAL1-D12 z dvema vezavnima mestoma ''tetO2'' za represor in fluorescirajoči protein yEGFP (angl. yeast enhanced green fluorescent protein) [1,3]. S spreminjanjem koncentracije induktorja so izmerili sigmoidno odvisnost odziva (Hillova krivulja) s strmim povečanjem pri vmesnih koncentracijah (50-90 ng/mL) [1,4]. Pri vmesnih koncentracijah induktorja je imel šum genskega izražanja vrh, pri manjših in večjih koncentracijah pa je šum bil veliko nižji. Analiza histogramov populacijskih porazdelitev je pokazala, da celice pri vmesnih koncentracijah induktorja neenakomerno preklopijo v stanje visokega genskega izražanja, kar vodi do visokega heterogenega izražanja reporterja in visokih nivojev šuma. To je problem za natančno izražanje genov in vivo. Na osnovi meritev so izdelali matematični model s sintezo represorja in reporterja. Simulacije so se dobro ujemale z izmerjenim odzivom in šumom. Simulacije so vrh šuma razložile z visokim represorskim šumom (konstitutivni promotor), ki ga ojačata velik odziv reporterskega reporterskega promotorja in sklopitev s počasno dinamiko promotorjev. Model nakazuje tudi, da se induktor najprej veže na prosti znotrajcelični represor, preden učinkuje na že vezan represor. Zaradi tega pride do velikega odziva blizu najnižje koncentracije induktorja, ki veže ves prosti znotrajcelični represor [1].

== Transkripcijska kaskada z negativno povratno zanko (linearizator) ==
Matematični model so uporabili za napoved rezultatov po vgradnji negativne povratne zanke v vezje. V vezju so zamenjali konstitutivni promotor s promotorjem PGAL1-D12 in ohranili reakcijske hitrosti. V literaturi so našli podatek, da je pri popolni indukciji prišlo do 30 % zmanjšanja hitrosti transkripcije regulatorja. Simulacije takega modela so predvidele linearen odziv vse do 90 % nasičenosti induktorja in zmanjšanja šuma pri vseh koncentracijah. Napovedi o linearizaciji so potrdili z meritvami do 60 ng/mL. Prav tako so linearnost preverili pri nizkih koncentracijah induktorja (od 0,1 ng/mL) in izključili nelinearnost na začetku krivulje zaradi zamika Hillove krivulje na levo. Prav tako je model pravilno napovedal enakomerno porazdelitev izražanja znotraj ozkega koncentracijskega območja in nizek nivo šuma pri vseh koncentracijah induktorja. Negativna povratna zanka je pri vmesnih koncentracijah induktorja zmanjšala šum do sedemkrat. Na koncu so še preverili, ali izražanje reporterskega gena odraža odziv regulatornega dela na induktor. Zato so sestavili vezje s fuzijskim proteinom tetR::yEGFP in promotorjem PGAL1-D12. Izmerjen odziv je bil linearen, nivoji šuma pa primerljivi s transkripcijsko kaskado z negativno povratno zanko [1].

== Preprosti matematični model razloži linearizacijo odziva in zmanjšanje šuma ==
Z zmanjšanjem števila biokemijskih reakcij in uporabo kinetike masne aktivnosti so dobili tri diferencialne enačbe:
dx/dt = aFx(x) - bxy - dx; 
dy/dt = C - bxy - fy; 
dz/dt = aFz(x) - dz.
Znaki x, y in z so koncentracije prostega znotrajceličnega represorja, induktorja in reporterja. C je parameter, sorazmeren koncentraciji zunajceličnega induktorja. Drugi parametri so a, hitrost proteinske sinteze, b, hitrost asociacije induktorja in represorja, d, hitrost redčenja zaradi celične rasti, in f, združene hitrosti redčenja, razgradnje in transporta induktorja iz celice. Disociacija induktorja z represorja poteka veliko počasneje, kot ostali procesi, zato je v model niso vključili. Funkciji Fx in Fz opisujeta odvisnost proteinske sinteze na regulatornih in reporterskih promotorjih od represorja. Če je Fx=1 funkcije opišejo vezje brez povratne zanke. Pod nasičenjem je asociacija prostega represorja in induktorja glavni vir razpada zanju in sta dx in fy zanemarljiva v primerjavi z bxy. Tako dobimo pri pogoju dinamičnega ravnotežja enačbo x = Fx^(-1)(C/a), kjer je Fx^(-1) inverzna funkcija Fx, kar kaže na to, da je koncentracija prostega represorja x popačena linearna funkcija C. Za reporter pa dobimo enačbo z = (a/d)Fz(x) = (a/d)Fz[Fx^(-1)(C/a)] = C/d, ki kaže, da reporterski promotor odpravi popačenost funkcije x(C), iz česar sledi linearna odvisnost C/d. Tako sta Fx in Fz povezani preko linearne transformacije z enačbo Fz(x(C)) = sFx(x(C+ᵠ)) + l. Parametri s=1, ᵠ=0 in l=0 opisujejo ista promotorja (Fx=Fz). Lizearizacija torej zahteva, da se popačenje na regulatornem nivoju odpravi na reporterskem nivoju. Linearizacija odziva nastopi, kadar sta Fx in Fz povezana z linearno transformacijo [1].

== Linearizacija odziva ni odvisna od števila vezavnih mest ==
Matematične napovedi o popačenju promotorja so preverili še z drugimi promotorji z enim (PGAL1-S1), dvema (PGAL1-D12) in tremi (PGAL1-T123) mesti ''tetO2''. Pri negativni regulaciji je bil naklon odziva promotorja z enim vezavnim mestom dvakrat večji kot pri ostalih dveh, medtem ko se je vrh šuma večal s številom vezavnih mest. Pri kombinaciji istih promotorjev v negativno povratno zanko so, v skladu z matematičnim modelom, povsod izmerili približno isti linearen odziv in naklon, kar nakazuje na neodvisnost linearizacije od promotorske moči in števila vezavnih mest. V naslednjem poskusu so zamenjali reporterski promotor PGAL1-D12 v izvornem linearizatorju s preostalima dvema. Primerjava odziva z odzivom PGAL1-D12 brez povratne zanke je pokazala različne represorske odvisnosti promotorjev. Za promotor PGAL1-S1 je bila znatno drugačna od PGAL1-D12, medtem ko je bila za PGAL1-T123 kvazi-enaka. Ko so v vezju z negativno povratno zanko zamenjali reporterski promotor so ugotovili, da ima kombinacija PD12-T123 višji naklon a linearen odziv, medtem ko odziv kombinacije PD12-S1 odstopa od premice. To je potrdilo model, da morata biti pri linearizaciji odziva promotorja (Fx in Fz) povezana z linearno transformacijo. Pri vseh poskusih je prišlo do zmanjšanja šuma, torej sta to neodvisni lastnosti vezij [1].

== Zaključek ==
Pri vezju z negativno regulacijo je bil odziv sigmoidna krivulja, ki je pri vmesnih koncentracijah induktorja (50-90 ng/mL) imela visok porast signala. Prav tako je bilo pri teh koncentracijah največ šuma, saj so celice zaradi heterogenosti genskega izražanja različno izražale reporterske gene. Meritve so omogočile nastanek matematičnega modela, ki se je ujemal z izmerjenimi rezultati in je napovedal obnašanje sistema z vgrajeno negativne povratne zanke. To je vključevalo linearizacijo odziva do 90 % nasičenosti z induktorjem in zmanjšanje šuma v celotnem koncentracijskem območju. Poskusi so te napovedi potrdile; prišlo je do linearizacije odziva (do 60 ng/mL) in zmanjšanja šuma. Pri vmesnih koncentracijah se je šum zmanjšal za sedemkrat. Obnašanje modela in sistema so opisali s preprostimi diferencialnimi enačbami, katerih rešitev za koncentracijo reporterskega proteina nam da linearno odvisnost od zunajcelične koncentracije induktorja. Pogoj za linearizacijo je povezanost obeh promotorjev (Fx in Fz) preko linearne transformacije oz. da se popačenost regulatornega promotorja odpravi z reporterskim. Z zamenjavo promotorjev so matematične rešitve in pogoje potrdili ter ugotovili, da je zmanjšanje šuma neodvisno od linearizacije in prisotno pri vseh uporabljenih vezjih. Trenutno ne obstajajo alternative za linearizacijo v evkariontskih sistemih za gensko izražanje. Podobni poskusi so bili izvedeni v E. coli, kjer je negativna povratna zanka zmanjšala šum v širokem območju koncentracij induktorja. Pri bakteriji je prišlo do šuma v obliki črke U zaradi različnega števila plazmidov in ga najbolje zatrejo vmesne koncentracije induktorja. Tega problema pri kvasovkah ni bilo, ker je bilo integrirano po eno vezje v kromosom. Sposobnost linearizatorja, da spremeni sigmoidno krivuljo v premico in enakomerno porazdeli gensko izražanje se bi lahko izkoristila za izgradnjo zanesljivih sintetičnih transkripcijskih omrežij. To je pomembno za pristop »bottom-up« in zaradi razširjene uporabe sistemov genskega izražanja tet v bakterijah, kvasovkah, žuželkinih in sesalskih celicah.

== Viri ==
[1] D. Nevozhay, R. M. Adams, K. F. Murphy, K. Josić, G. Balazsi. »Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression.« PNAS 2009, let. 106, št. 13, str. 5123-5128.

[2] J. L. Ramos, M. Martinez-Bueno, A. J. Molina-Henares, W. Teran, K. Watanabe, X. Zhang, M. Trinidad Gallegos, R. Brennan, R. Tobes. »The TetR Family of Transcriptional Repressors.« Microbiology and molecular biology reviews 2005, let. 69, št. 2, str. 326-356.

[3] B. P. Cormack, G. Bertram, M. Egerton, N. A. Gow, S. Falkow, A. J. Brown. »Yeast.enhanced freen fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans.« Microbiology 1997, let. 143, št. 2, str. 303-311.

[4] Hill equation (biochemistry).Dostopno na: https://en.wikipedia.org/wiki/Hill_equation_(biochemistry) [2. 1. 2019].