Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu

"Povzeto po članku Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324.”

Uvod

Nekodirajoče bakterijske RNA, med katere spada protismerna RNA (asRNA – antisense) in mala RNA (sRNA – small) postajajo pomembno orodje v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, ker omogočajo regulacijo izražanje genov brez popolnega izbijta gena. Z nepopolnim parjenjem baz se sRNA vežejo na mRNA, pogosto v bližino ribosom-vezavnega mesta (RBS) ali pa preprečijo oz. ojačajo vezavno na ribosom preko drugih mehanizmov [1,2] . Tehnologija asRNA oz. sRNA se uporablja za detekcijo metabolnega stanja, uravnovešenje metabolnih poti, za kontrolo izražanja toksinov, za izboljšanje izkoristka in zmanjšanja količine stranskih produktov [1]. Večina aplikacij asRNA se izvaja v živih celicah. Vendar ima tak pristop kar nekaj pomanjkljivosti kot so kompleksnost živih celic, selektivna indukcija, naravna variabilnost, težave pri standardizaciji in neponovljivost rezultatov. Zato se razvija brezcelične sisteme (cell-free systems – CFS), ki vsebujejo celično komponente in vitro. Z uporabo CSF se izognemo kompleksnosti živih celic, zato je delo v takih sistemih bolj fleksibilno, možen je večji nadzor nad modifikacijami transkripcije/translacije, lahko se proizvede večje količine produktov, višja toleranca za toksične substrate/produkte/intermediate, lažje čiščenje produktov [1]. V članku Tannaiche et al so se ukvarjali z ugotavljanjem funkcije sRNA, neodvisne od Hfq, ki cilja različne dele mRNA fluorescenčnega barvila Anemoina majano cyan (AmCyan) ter encima diaforaza. Razvili so sRNA, ki poleg utišanja genov omogoča tudi prekomerno izražanje tarčnega proteina, kar do tedaj še ni bilo zabeleženo. Testiranje so najprej izvedli in vivo, vendar so zaradi nekonsistentnih rezultatov prešli na brezcelični sistem [1].

Konstrukcija sRNA in plazmidov v sistemu z reporterjem AmCyan

Sintetični konstrukt sRNA je dolg 48 nukleotidov in je sestavljen iz treh delov. Zaporedje na 5' koncu tvori steblo-zanko, s čemer stabilizira RNA in omogoča interakcijo sRNA-mRNA (14 nk). Temu sledi 20 nukleotidov dolgo protismerno zaporedje za tarčno mRNA, ki cilja različne dele AmCyan. Na 3' koncu sRNA je še terminator v obliki stebla-zanke (14 nk) [1].

Uporabljeni plazmidi za testiranja sistema z reporterjem AmCyan Uporabili so štiri različne plazmide. Prvi je pART15-C1 vsebuje zapis za reporterski fluorescenčni protein Anemoina majano cyan (AmCyan) pod inducibilnim promotrojem PBAD. Drugi uporabljen plazmid je pART15-C2, ki ima zapis za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PLtetO-1 in omogoča relativno določitev izražanja sRNA. Plazmid pART15-C1-LacZ ima sRNA konstrukt substituiran z lacZ in omogoča belo modri test po transformaciji bakterij. Zadnji plazmid je pART15-AS, ki vsebuje gen za reporter AmCyan pod kontrolo promotorja PBAD in zaporedje za sRNA pod kontrolo promotorja PLtet-O [1]. Sestavljanje konstrukta je potekalo z Gibbosonovim kloniranjem in gama-PCR.

Optimizacija indukcije s plazmidom pART15-C1 in -C2 (in vivo sistem)

Za oceno izražanja reporterja AmCyan in sRNA v odvisnosti od koncentracije induktorjev so uporabili dva kontrolna plazmida: pART15-C1 in pART15-C2 in z njima transfecirali sev E. coli 10-. Merili so fluorescenco AmCyan pri različni koncentracijah induktorjev arabinoze (Ara) in anhidrotetraciklina (ATc) [1]. Med koncentracijo Ara oz. ATc in intenziteto fluorescence je bil opažen linearen odnos. S tem so pokazali, da se izražanje fluorescentnega reporterja in sRNA uravnava čez široko območje z uporabo omenjenih induktorjev [1]. S pretočno citometrijo so ocenili homogenost indukcije v celičnih populacijah pri različnih koncentracijah induktorjev Ara in ATc [1].

Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan (in vivo)

Testirali so 12 različnih protismernih zaporedji s transformacijo seva E. coli 10- beta s plazmidom pART15-AS in merili fluorescenco celic v treh časovnih točkah (6, 18, 29 h) [1]. V prvem in vivo sistemu so pokazali, da je ciljanje RBS in prvih 20 baz mRNA reporterja AmCyan povzročilo signifikantno znižanje izražanja do 10% v 29 urah. Še bolj signifikantno znižanje izražanja reporterja je bilo prisotno pri ciljanju visoko-energijskega stebelnega dela sekundarne strukture mRNA (asB430), kjer so v šestih urah dosegli 25% utišanje. Ostale sRNA, ki ciljajo druge regije iniciacije translacija so dosegle signifikantno znižanja izražanja šele po dolgem času gojenja. Ciljanje visoko-energijskega stebla, ki je bolj oddaljen od mesta začetka translacije (asB407 in asB539) je v nekaterih primerih signifikantno znižalo fluorescenco, v drugih pa ne. Pri poskusu z asB606, ki cilja nizko-energijsko steblo, so izmerili signifikantno povišanje fluorescence pri 18h, vendar pri 29h signifikantnega povišanja ni bilo več prisotnega [1]. Čeprav so v in vivo sitemu dokazali nekaj signifikantnih sprememb izražanja reporterskega proteina, so rezultati zelo variirali, kar je verjetno posledica kompleksnosti živih celic. Zato so poskuse nadaljevali v brezceličnem sistemu [1].

Brezcelični sistem (CFS)

CFS sistem so pripravili s sonifikacijo celice, ki so bile predhodno transformirane s plazmidom pART15-AS nato inducirali izraženje z Ara in ATc. Tako kot in vivo so najprej potrdili, da je odnos med intenziteto fluorescence in koncentracijo induktorja (Ara in ATc) linearen. Indukcija je bila dosežena po 24h, maksimum pa je fluorescenca dosegla po 96 urah. Podatki o fluorescenci so bili v CFS veliko bolj konsistentni kot in vivo, poleg tega pa je bilo prisotnih več signifikantnih rezultatov [1].

Vpliv sRNA na izražanje reporterja AmCyan v v brezceličnem sistemu

Ciljanje RBS v sistemu CFS ni povzročilo znižanja fluorescence, ciljanje prvih 20 nk pa je ravni izražanja znižalo bolj kot in vivo. S ciljanjem sekundarnih struktur mRNA so dosegli še močnejše utišanje; ciljanje visoko-energijskega stebla je povzročilo kar 65% utišanje , ciljanje 3' konca mRNA (asB701) pa je utišalo izražanje za kar 70% (in vivo le 19%). Pri ciljanju nizko-energijskega stebla (asB606) pa so dobili presenetljive rezultate, ki drugje v literaturi niso zabeleženi, in sicer je prišlo do signifikantnega zvišanja fluorescence za več kot 66%. Pri ciljanju drugega dela nizko-energijskega stebla (asB615) se je fluorescenca znižala [1].

Vpliv sRNA, odvisne od Hfq, na izražanje reporterja AmCyan

Nadaljnjo jih je zanimalo, ali lahko rezultate reproducirajo z uporabo sRNA, ki je odvisna od Hfq. V ostalih poskusih so namreč uporabljali sintetično sRNA, ki ni odvisna od Hfn. Uporabili so naravno pristno sRNA MicC, ki je vpletena v utišanje proteina zunanje membrane OmpC v E. coli in izkazuje visoke ravni utišanja genov. Protein Hfq deluje kot RNA šaperon MicC [1]. K ogrodju MicC so dodali ista protismerna zaporedja kot pri od-Hfq-neodvisni sRNA. Ciljanje prvih 20 nk mRNA s MicC-asB1 je vodilo v znižanje fluorescence, ki je bilo večje kot pri uporabi od-Hfq-neodvisne asRNA. Pri testiranju z MicC-asB606 ni bilo spremembe fluorescence, medtem ko je bilo pri sintetičnem ogrodju zvišanje flourescence kar 65%. Ciljanje RBS z MicC-asRBS je povzročilo zvišanje flourescence, kar se ne sklada z objavljenimi rezultati drugih v vivo študij, vendar so v nadaljevanju študije tudi ta pojav pojasnili [1].

Določanje mehanizma delovanja sRNA asB606 z NUPACK in catRAPID

Za določanje mehanizma, ki povzroči prekomerno ekspresijo z asB606 sRNA, so za analizo uporabili program NUPACK, ki se uporablja za analizo načrtovanje struktur ter sistemov nukleinskih kislin [1,3]. Ugotovili so, da se asB606 veže na bazne bare 606-615 na AmCyan mRNA, ki tvorijo začetni del stebla-zanke zaščitenega 3' konca in je tudi prepoznavno mesto za RNaza E, ki po prepoznavi tudi cepi AmCyan mRNA. Vezava sRNA na to mesto oteži prepoznavo mRNA z RNazo E in s tem prepreči cepitev in posledično podaljša razpolovno dobo mRNA, kar vodi v zvišanje izražanja AmCyan in povišanja fluorescence. Vezavni potencial med RNazo E in AmCyan mRNA, določen s programom catRAPID, je bil v regiji 500-600 visok, kar pa še dodatno podpira teorijo, da sRNA asB606 zakrije prepoznavno mesto za RNazo E [1]. Z analizo NUPACK so analizirali tudi zvišano izražanje z MicC-asRBS, kjer takšnih rezultatov niso pričakovali. V nativni AmCyan mRNA je 5' konec zvit v stebelno sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo. Vezava MicC-asRNA na mRNA preprči nastanek takšne sekundarne strukture, s tem pa “sprosti” RBS in omogoči vezavo na ribosom [1].

Regulacija izražnja diaforaze s sRNA in vitro

Diaforaza (DI) je topna NAD(P)H dehidrogenaza, ki je vpletena v nastanek NADH in NADPH v anaerobnih pogojih [1,4]. Uporablja se v sinteznih encimskih poteh za produkcijo visoko-vrednih kemikalij. Zato je zvišano izražanje tega encima tudi zanimivo in uporabno [1]. Z uporabo catRAPID so predvideli vezavna mesta za RNazo E na diaforazni mRNA in identificirali štiri tarčna mesta za sRNA, ki se nahajajo v bližini stebelnih zank in vezava, na katera bi lahko povzročilo zvišano izražanje [1]. Protismerna zaporedja, ki so bila del sRNA, so klonirali v plazmid pBAD-LIC in z njim transformirali sev E.coli BL21 Star (DE3). Brezcelični sistem so naredili s hkratno sonifikacijo kultur E.coli , ene, ki vsebuje zapis za diaforazo in druge z rekobinanitim plazmidom pBAD-AS [1]. Dva konstrukta (as410, as528) sta signifiakntno povečal izražanje diaforaze, en je dosegel zelo nizko povečanje (as510), zadnji pa je v enem replikat povišal izražanje, v drugih pa ni imel vpliva (as490) [1]. Čeprav so vsi konstrukti vsebovali protismerno zaporedje, ki cilja vezavno mesto za RNazo E na diaforazono mRNA, so bili vplivi konstruktov raznoliki. Rezultati so lahko posledica prisotnosti več vezavnih mest za RNazo E, poleg tega pa uporabljen sev E.coli lahko metabolizira induktor Ara in s tem zniža izražanje sRNA [1].

Zaključek

Naravne in sintetične sRNA imajo velik potencial v sintezni biologiji in metabolnem inženirstvu, saj omogočajo regulacijo izražanja genov brez popolnega izbitja gena, preko induciranega izražanja sRNA pa se lahko uvede še večji nadzor nad regulacijo izražanja tarčenga gena. So majhne, kar omogoča izražanje več sRNA iz istega plazmida. Tannaiche et al so prvič pokazali, da s sRNA lahko selektivno tudi zvišamo izražanje tarčnega gena v CFS. Poleg tega pa so pokazali, da se lahko sRNA prilagodi na različne sisteme in na regulacijo različnih proteinov [1].

Literatura

[1] Tanniche I, Nazem-Bokaee H, Scherr DM, Schlemmer S, Senger RS. A novel synthetic sRNA promoting protein overexpression in cell-free systems.Biotechnol. Prog. 2023;e3324. doi:10.1002/btpr.3324

[2] Storz G, Vogel J, Wassarman, K M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers. Molecular Cell. 2011. 43(6), 880–891.doi:10.1016/j.molcel.2011.08.022

[3] NUPACK. https://www.nupack.org (nazadnje dostopano 14. 5. 2023 dostopano)

[4] AG Scientific: Diaohorase Enzymes – Why are they? https://agscientific.com/blog/all-about-diaphorase-enzymes.html (nazadnje dostopano 14.5.2023)