Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih

Uvod

V evkariontskih celicah se večina sekrecijskih in transmembranskih proteinov prepiše, modificira in zvije v endoplazmatskem retikulumu (ER). V primeru, da pride do navala proteinov, se bodo v ER začeli kupičiti nepravilno zviti proteini. Ta pojav poznamo kot stres na endoplazmatskem retikulumu (»ER stress«). Da lahko celica preide nazaj v homeostazo, se v njej vključi t.i. nezviti proteinski odziv (»Unfolded protein response«). Ta je sestavljen iz treh različnih poti, ki so vzdražene preko ER senzornih proteinov: PKR-podobna ER proteinska kinaza (»PRK-like ER protein kinase«), aktivacijski transkripcijski faktor-6 (»activating transcriptional factor-6«, ATF6) in od inozitola odvisen protein 1 (»inositol-requiring protein-1«, IRE1). Gre za transmembranske proteine, ki so sestavljeni iz citosolne in luminalne domene. Slednja prepoznava napačno zvite oblike proteinov v ER. Citosolna domena je tista, ki prenese dani signal jedru, kjer se nato aktivira specifičen set genov. Virusi v času infekcije celice povzrožajo stres na ER in posledično se aktivira UPR. Da ti lahko v celici preživijo, so razvili različne mehanizme, ki blokirajo te odzive.

UPR in možni mehanizem stresa na ER, ki ga povzroča koronavirus

V času stresa na ER, PERK posreduje pri fosforilaciji eIF2α. Preko dane fosforilacije pride do prekinitve globalne translacije, hkrati pa se omeji proteinski transport v lumen ER. Ob sami fosforilaciji evkariontskih iniciacijskih faktorjev α (eIF2α) je prednostno sintetiziran protein ATF4. Eden izmed genov, na katerega slednji vpliva, je GADD34. Gre za regulatorno podenoto, ki pomaga PP1 (proteinska fosfataza 1), da defosforilira eIF2α ter deluje kot negativna povratna zanka pri PERK signalizaciji. Avtofosforilacija IRE1 pomeni sama aktivacija proteina in posledično vzbujanje njegove RNazne domene, ki ima lastnost, da odstrani intron na zapisu za X-box protein 1 (XBP1). Takšna oblika proteina je dalje importirana v nukleus celice, kjer se sproži signal za izražanje UPR genov. Med te gene štejemo različne ER šaperone, kot tudi komponente, ki so vključene v ERAD poti (»ER-associated degradation pathway«). Ob povečani koncentraciji napačno zvitih proteinov se aktivira ATF6. Pride do translokacije iz ER v Golgi, kjer nanj delujejo razne proteaze, zato da se v nadaljnje lahko izrazi citosolna domena ATF6 in je dalje transportirana v jedro celice. V jedru spodbuja izražanje UPR genov, kot so šaperoni in nekateri ERAD proteini. Pomembna značilnost UPR pa je, da ER senzorni proteini med sabo vplivajo drug na drugega. Za celice, ki so okužene s koronavirusom je znano, da se v njih bolj izražajo GRP78, GRP94 in drugi s stresom na ER povezani geni. V dani raziskavi so poleg SARS-CoV uporabili še mišji koronavirus (MHV) in ptičji koronavirus (IBH). Koronavirus sproži stres na ER preko treh potencialnih procesov. 1. Translacija, zvijanje in modifikacija velikega števila koronavirusnih proteinov; bolj podrobno tiste, ki so močno vezani na N-glikoziliran spike protein, ki posledično poveča obremenitev ER v okuženih celicah. 2. Preko prerazporeditve membrane ER pride do nastanka dvojnomembranskih veziklov (DMVs). V celicah okuženimi z danimi koronavirusi so se prekomerno izražali virusni nestrukturirani proteini kot so nsp3, nsp4 in nsp6. 3. Morfologija in brstenje zrelih virusnih delcev izčrpavajo membranske komponente ER. Samo zbiranje in brstenje se pojavi v tubulovezikularnem kompartmentu (ERGIC).

Ob okužbi celice s koronavirusom se aktivirajo številne signalne poti, ki jih virus izkorišča z namenom vzpostavitve primernega celičnega okolja za njegovo replikacijo in širjenje. Večino teh signalnih poti lahko prekomerno aktivirajo virusni proteini, ki v končni fazi povzročijo izločanje vnetnih citokinov ali apoptozo. Pomembno vlogo v formiranju odgovora na tovrsten celični stres imajo MAP kinaze, ki oblikujejo t.i. MAPK kaskado. Ta je sestavljena iz vsaj treh zaporedno delujočih kinaz, pri čemer vsaka fosforilira in s tem aktivira naslednjo kinazo v kaskadi. Do zdaj so v živalskih celicah odkrili 4 podskupine omenjenih proteinov, izmed katerih se na okužbo odzivata p38 MAPK in JNK.

p38 MAPK in Sars-CoV-2

p38 je serinska-treoninska kinaza, ki jo aktivira MKK3, MKK4 ali MKK5 s fosforilacijo dveh aminokislinskih ostankov (T, Y) aktivacijske zanke. Po aktivaciji se translocira v jedro in aktivira več efektorskih proteinov. p38 MAPK signalna pot ima zelo raznovrstno vlogo v formaciji celičnega odgovora, predvsem je odvisna od tipa okužene celice in dražljaja. Tako lahko p38 MAPK promovira celično smrt in preživetje.

Sars-CoV-2 vstopi v celico preko vezave na ACE2 (Angiotensin Converting Enzyme 2), ki se nahaja na celični površini v različnih tkivih, močno pa je izražen v pljučih in srcu. Ima pomembno vlogo pri regulaciji uravnavanja krvnega pritiska, celjenja ran, vnetja itd. Vzrok za močno vnetje, ki ga povzroči Sars-CoV-2, ni popolnoma znan, ampak jo lahko razložimo z različnimi signalnimi potmi. Ena izmed signalnih poti, ki je bila uporabljena za razlago akutnih pljučnih poškodb in poškodb miokarda je bila singalna pot p38 MAPK, ki ob aktivaciji privede do izločanja vnetnih citokinov IL-6, TNF-α in IL-1β. Po vstopu virusa v celico, ACE2 pretvori angiotenzin II (Ang II) v angiotenzin 1-7 (Ang 1-7), ki se nato veže na receptor Mas. Vezava Ang 1-7 na Mas inhibira aktivno p38 MAP kinazo in s tem delovanje Ang II preko MAPK kaskade. Zaradi zmanjšanja števila receptorjev po infekcji celice se količina Ang II poveča, količina Ang 1-7 pa se zmanjša. Takšno stanje ustvarja pozitivno zanko, namreč aktivacija MAP p38 poveča količino proteaze ADAM17, ki cepi ektodomeno receptorja ACE2 in mu s tem zmanjša lokalno (zaščitno) delovanje.

Posledica aktivacije opisane signalne poti je aktivacija številnih transkripcijskih faktorjev (Hsp-27, CREB, ATF-1), ki so delujejo kot anti-apoptotski faktorji. p38 vodi tudi do fosforilacije iniciacijskega faktorja eIF4E, ki pospeši translacijo mRNA molekul z dodano kapo. Ta mehanizem uporablja virus mišjega hepatitisa (MHV) za spodbujanje sinteze virusnih proteinov.

JNK in Sars-CoV

Aktivacija JNK (c-Jun N-terminal Kinase) poteče podobno kot v primeru p38. Gre za fosforilacijo dveh aminokislinskih ostankov (MKK4, MKK7). Po aktivaciji se translocira v jedro in aktivira različne transkripcijske faktorje (eden izmed njih je c-Jun, po katerem ima kinaza tudi ime). Mitzuni in sodelavci so v študiji z uporabo specifičnih inhibitorjev za JNK in Akt (signalna pot, ki promovira celično rast in preživetje) pokazali, da je za dolgotrajno okužbo nujna neokrnjena signalizacija prek omenjenih signalnih molekul. Fosforilacija JNK verjetno poteče zaradi prisotnosti Sars-CoV N proteina, kar so pokazali ob dodani vakcini za ekspresijo N proteina. Pri tem smo zaznali fosforiliran JNK in Akt. Nasprotno pa nismo zaznali povišane koncentracije Bcl-xL in Bcl-2 ob izražanju Sars-CoV N proteina, kar nam pove, da nista del signalne poti JNK.

Kako koronavirusi uravnavajo translacijo

Koronavirusi se replicirajo znotraj citoplazme gostujoče celice, kjer producirajo 5 do 9 genomskih mRNA. Vsi mRNA-ji vsebujejo pogosto 5'-vodečo sekvenco. Ta 5' sekvenca se veže na N protein. Nastane kompleks, ki se lahko obnaša kot močen signal za iniciacijo translacije in spodbuja virusno mRNA translacijo. mRNA1 kodira dva prekurzorja, pp1a in pp1b. Oba poliproteina sta proteolitično cepljena s tremi encimi v 13 do 16 miniaturnih nestrukturiranih proteinov. Veliko teh se udeležuje v virusni mRNA replikaciji in transkripciji. Virus izkoristi translacijsko mehaniko gostujoče celice, da zaključi translacijo virusnih proteinov. Kot odgovor na virusno infekcijo gostujoča celica zaustavi sistem translacije proteinov, da se sooči z infekcijo in stresom. Vključi se UPR. Da virusi lahko nadaljujejo s produkcijo morajo UPR ovire premagati. Koronavirusne mRNA so 5'-cap in 3'-poliadenilizirane kar je strukturno enako gostujočim mRNAjem. Zaradi tekmovanja med mRNA virusa in gostujoče celice za ribosome in podobne faktorje mora koronavirus prevzeti translacijsko mehaniko gostujoče celice, da producira svoje virusne proteine. V študijah koronavirusov, kot npr. SARS-CoV, MERS, MHV, TEGV je pokazalo, da te sprožijo prekinitev translacije gostujoče celice. Ustavitev proteinske translacije v celici se ne zgodi samo zaradi mRNA degradacije in ribosomske disfunkcije specifičnih virusnih proteinov, ampak se zgodi tudi zaradi stresnih dražljajev virusne infekcije. Te stresni dražljaji inducirajo prekinitev translacije preko fosforilacije eIF2α. Ta skupaj z eIF2β in eIF2γ sestavlja eIF2 in vzpodbuja vezavo Met-tRNAi na ribosom v GTP odvisnem načinu. Ko je iniciacija zaključena se eIF2-GDP sprosti iz ribosoma in GDP se zamenja za GTP kar formira aktivni elF2-GTP, ki se udeležuje v novem krogu translacijske iniciacije. elF2 je deaktiviran s fosforilacijo eIF2α. Torej je fosforilacija eIF2α nadzorna točka iniciacije sinteze proteinov in olajša stres tako, da konča translacijo v času stresne okužbe. Ker pa je vloga eIF2α pri iniciaciji translacije pomembna, je koncentracija fosfor-eIF2α regulirana pod stresom okužbe. PERK se aktivira ob preveliki količini virusnih proteinov v ER. Pri stresnem odgovoru ob okužbi sta glavni kinazi PKR in PERK. Dvojno vijačna RNA se veže na PKR in povzroči konformacijske spremembe kar vodi do dimerizacije in autofosforilacije te kinaze. PKR fosforilira eIF2α in inhibira sintezo proteinov in tako sproži antivirusni efekt. PKR in PERK inhibirata globalno proteinsko sintezo in zmanjšata širitev virusa, tako da inaktivirata eIF2α. Velike količine fosfor-eIF2α vodijo do translacije transkripcijskih faktorjev ATF4. Veliko virusov kodira virusni protein, ki imitira GADD34, saj tako lahko pomaga sintezi virusnih proteinov. Pri koronavirusih je bilo pokazano, da SARS-CoV infekcija aktivira PKR in PERK s fosforilacijo, kar vodi do trajne fosforilacije eIF2α v specifičnih celicah. Aktivacija PKR ne sodeluje pri fosforilaciji eIF2α in virusni replikaciji, ampak igra vlogo pri virusno inducirani apoptozi. Nekateri koronavirusi za normalno sintezo proteinov preprečijo eIF2α fosforilacijo. IBV najprej aktivira PKR in PERK potem pa kasneje zavira njihovo aktivacijo. Ta prav tako aktivira povečano ekspresijo GADD34. Ko pride do supresije kinaz in povečane ekspresije GADD34, je fosfor-eIF2α reduciran na majhne količine ob pozni infekciji, kar vodi v stabilno sintezo proteinov skozi infekcijo.

Koronavirusni nsp1 je najbolj N-terminalni produkt pp1a in ga kodirata samo dve vrsti, α in β koronavirus. Ta protein je zelo divergenten, njegova funkcija pa je regulacija gostujočih in virusnih genskih ekspresij. Pri β koronavirusih (SARS-CoV) je bil protein nsp1 najprej identificiran za blokado ekspresije obveščevalnih genov. Gre za inaktiviacijo 40S ribosomalne podenote in tako prepreči virusno in celično mRNA translacijo. Nsp1-40S ribosomalni kompleks spodbuja degradacijo celične mRNA preko endonukleolitično cepitev mRNA na 5' delu capped mRNA. Virusna mRNA je zaščitena pred cepitvijo zaradi 5' konec vodilne sekvence. Študije in vivo kažejo, da SARS-CoV nsp1 nevtralizira imunski odgovor gostujoče celice tako, da zatira ekspresijo genov v gostujoči celici. V α koronavirusih (TEGV) nsp1 zatira translacijo mRNA gostujoče celice brez, da bi vplival na njeno stabilnost. Ta protein inhibira translacijo drugih sporočevalcev mRNAjev v celicah, ampak ne v vseh in vitro translacijskih sistemih, kar kaže na to, da je TEGV nsp1 odvisen od gostujočih faktorjev za efekt inhibicije.