Odkritje izvora vmesnikov

Uvod

Virusi so znani kot tipični primer ogrožanja celičnega življenja, ne samo za bakterije in arheje, ki predstavljajo večino življenja na Zemlji, ampak tudi za ostale višje organizme, zato so le ti razvili veliko mehanizmov s katerimi preprečijo okužbo, ki jo povzročajo virusi. Tak sistem pridobljenega imunskega odgovora je pri prokariontih sistem CRISPR-Cas, ki omogoča poleg preprečevanja okužbe z virusi, tudi vpogled v poznavanje interakcij med gostiteljem in virusom.[1]

Lokus CRISPR (gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev) je bil sprva opažen v Escherichii coli že leta 1987. Takrat so prepoznali vrsto ponovitev kratkih zaporedij vzdolž gena iap (inhibitor apoptoze), vendar še niso znali pojasniti biološke vloge teh zaporedij, saj je bilo podatkov o sekvencirani DNA bolj malo.

Tako je ostalo vse do leta 2005, ko se je zgodila velika in pomembna sprememba glede razumevanja narave in funkcij regij CRISPR. Kljub temu, da biološka vloga regij CRISPR takrat še ni bila poznana, so jim že pripisali določene funkcije, kot sta na primer razvojna regulacija in popravljanje DNA. Mnogo med seboj neodvisnih raziskovalnih skupin, med katerimi so med pomembnejšimi tiste pod vodstvom F. Mojice, C. Pourcela in A. Bolotina, je odkrilo, da so vmesniki, ki ločujejo ponavljajoča se zaporedja, velikokrat homologna fragmentom iz mobilnih genetskih elementov (fagov, plazmidov in transpozonov). Predlagali so, da so izvenkromosomskega izvora in so verjetno pomembni kot del prokariontskega imunskega sistema. Poleg tega pa so želeli s pomočjo razumevanja izvora vmesnikov pojasniti biološko vlogo ponovitev CRISPR. Bolotin pa je odkril še prisotnost cas (s CRISPR povezani geni) genov na lokusu CRISPR, ki prej niso bili podrobno opisani. Predvideval je, da le ti kodirajo za velike proteine imenovane Cas9, ki imajo nukleazno aktivnost. Potem je opazil še, da si vmesniki, ki so homologni virusnim genom, z njimi delijo enako sekvenco na koncu, imenovano PAM (protospacer adjacent motif).[2]

Raziskave

Raziskovalna skupina pod vodstvom F. Mojice

Raziskovalci pod vodstvom F. Mojice so se osredotočili na to, da bi jim lahko odkritje izvora vmesnikov pomagalo pri tem, da bi določili biološko funkcijo ponovitev CRISPR. V ta namen so se lotili sistematskega raziskovanja identitet vmesnikov ter tako prišli do spoznanja, da so si le ti signifikantno podobni z nekaterimi DNA molekulami.

Kot eksperimentalno metodo, so uporabili PCR in sekvenciranje nukleotidov. Kot predstavnike štirih prokariontskih skupin so za raziskave uporabili seve krenarhej Sulfolobus, gram-pozitivne bakterije Streptococcus pyogenes, gram-negativne bakterije E. Coli in euriarheje Methanothermobacter.

Ugotovili so, da vmesniki niso unikatni, kot je bilo znano do leta 2002 ampak izhajajo iz prej obstajajočih sekvenc. Največja podobnost vmesnikov iz posameznih sevov različnih vrst prokariontov se je pokazala z genetskimi elementi. Okoli 65% vmesnikov je bilo homolognih z bakteriofagi ali konjugativnimi plazmidi ostalih 35% pa s kromosomskimi sekvencami. Na koncu raziskave so zaključili, da še vedno niso prepričani ali je CRISPR odgovoren oziroma prisoten pri pridobljenem imunskem sistemu prokariontov ali ne, jasno pa jim je bilo, da virusi, kljub temu da lahko preidejo v celico, le te ne morajo okužiti, če ta vsebuje vmesnike, ki so homologni fagni sekvenci.[1]

Raziskovalna skupina pod vodstvom C. Pourcel

Ta skupina, se je osredotočila na raziskavo CRISPR elementov v sevih gram-negativne bakterije Yersinia pestis, ki je sicer povzročiteljica kuge. Zopet so uporabili PCR tehniko in sekvenciranje, da so lahko nato posamezne odseke bakterijske DNA primerjali z regijami v bazi podatkov. Našli so tri CRISPR elemente dolge okoli 28 bp, ki jih prekinjajo vmesniki dolgi med 32 in 33 bp. Imenovali so jih YP1, YP2 in YP3. Ugotovili so, da je YP1 povezan s cas1 in cas3 geni, niso pa še znali pojasniti kakšna je vloga teh genov.[3]

Raziskovalna skupina pod vodstvom A. Bolotina

Lotili so se analize genoma gram-pozitivne bakterije Streptococcus thermophilus. Kot tehniko so uporabili sekvenciranje, s katerim so zopet naredili primerjavo med regijami na genomu bakterije z bazo podatkov NCBI. Odkrili so lokus dolg 2-7 kb, ki ima tipično CRISPR organizacijo; 42 ponovitev po 36 bp, ki so ločene z vmesniki dolgimi 30 bp. Lokus je vseboval dve duplikaciji in sicer eno po pet ponovitev in po pet vmesnikov in drugo iz ene ponovitve in enega vmesnika. Ta skupina je ugotovila, da so s CRISPR ponovitvami povezani tudi Cas proteini, za katere kodirajo cas geni, ki so jih tudi odkrili na lokusu CRISPR.

Rezultati so pokazali, da je 40% bakterij vsebovalo vmesnike CRISPR, ki so bili homologni sekvencam iz NCBI zbirke podatkov. Večina (75%) jih je bilo homolognih s fagi, 20% pa jih je bilo homolognih s plazmidi. Zopet so tako potrdili izvor vmesnikov, ki je izvenskromosomski. Poudarili so tudi, da sicer ne poznajo še popolnega mehanizma CRISPR, ugotovili pa so da so cas geni tesno povezani s strukturami CRISPR in da zagotovo sodelujejo pri samem mehanizmu.[4]

CRISPR-Cas imunski odziv

Plenilsko obnašanje virusov je lahko nevarno za katero koli celico, posebej če so napadalci v veliko večjem številu. Vsaki celici na svetu namreč lahko pripišemo približno 10 virusov, ki jo lahko napadejo in tako prenesejo svoje dedne informacije. Zaradi tega se razvil imunski odgovor, kot protiutež tem napadom. Poznamo prirojeni in pridobljeni imunski sistem, in prav zadnji, ki je specifičen za vretenčarje, s katerim pridobimo prednost zaradi pomnjenja patogenov, je presenetil raziskovalce, ko so odkrili podoben sistem tudi pri prokariontih. Ta sistem je torej CRISPR-Cas in ga lahko opredelimo kot obramba proti virusi, z napadom na tujo DNA in RNA, ter ostale genetske elemente.[5]

Osnovno delovanje obrambnega mehanizma lahko razdelimo na tri dele:

1. Prilagoditev: Pri prilagoditvi, se v lokus CRISPR vstavi nov vmesnik, torej, se v bakterijski genetski zapis vnese del virusnega genetskega zapisa.

2. Ekspresija: Potek transkripcije lokusa CRISPR, torej prepis vmesnika in iz njega nastanek nove CRISPR RNA (crRNA).

3. Interferenca: Nova CRISPR RNA in Cas proteini zaznajo in razgradijo tuj genetski material, ter tako preprečijo ponovno okužbo celice z virusom.

Raznolikost CRISPR-Cas sistema in kratek povzetek glavnih skupin

Splošen opis pomembnih regij in kaj nam je trenutno znano, lahko pripomore k boljši razlagi mehanizma delovanja takšnega imunskega odziva. Dolžina ponavljajočih se zaporedij se giblje med 21 in 48 bp, ter vmesnikov med 26 in 72 bp, prav tako je različno število vmesnikov ki se pojavijo, kar pa je odvisno od tega, kolikokrat je virus okužil dano bakterijo. Zaporedja vmesnikov in ponavljajočih se zaporedij so dobro ohranjena, vendar se lahko razlikujejo med CRISPR sistemi znotraj istega genoma. Zaradi nalaganja vmesnikov v zaporedje, eden za drugim, lahko tudi kronološko določimo okužbe bakterij z virusi.

Lokus CRISPR se znotraj genoma lahko pojavi enkratno ali večkratno, odvisno od organizma. Razpon CRISPR sistema je tako dokaj signifikanten, ponekod tvori tudi do 1% celotnega genoma.

Da CRISPR lahko deluje kot imunski sistem, pa so prav tako pomembni Cas proteini, vendar ne vedno, saj nekateri lokusi nimajo pritrjenih cas genov, pač pa se za delovanje zanašajo na trans kodirajoče faktorje. Drugi pomemben faktor pa je vodilno zaporedje, nahaja se med cas geni in CRISPR zaporedjem, v katerem se nahajajo promotorji za prilagoditveni del obrambnega mehanizma in transkripcijo.

Cas proteini pa so tudi zelo raznolika skupina proteinov, kateri v veliki večini delujejo kot helikaze in nukleaze, z nukleinskimi kislinami pa se lahko povežejo kot RNA – vezavni proteini. Dva izmed teh proteinov sta ohranjena in univerzalna za vsak CRISPR-Cas sistem, to sta Cas1 in Cas2, ki sta vključena v proces prilagoditve, ostali pa so specifični za druge vrste CRISPR-Cas sistemov.

Zaradi pogostosti lokusa CRISPR v genomu in raznolikosti Cas proteinov, se CRISPR-Cas sistemi lahko delijo na zelo veliko skupin, vsaka specifična svoji nalogi.[5]

Prilagoditev

Po okužbi z bakteriofagno DNA pride do procesa prilagoditve, ki poteka v več stopnjah. Prvi korak je prepoznavanje in izbira protovmesnika, druga stopnja je njegova integracija oziroma vstavitev v lokus CRISPR, ki ji sledi sinteza nove ponovitve.

Izbira vmesnika je določena s strani kratkega motiva poleg tarčnega zaporedja imenovanega protovmesniku sosednji motiv (angl. protospacer adjacent motif, PAM). Prepoznavanje PAM regije je pri vsakem tipu sistema CRISPR-Cas nekoliko drugačno. Odvisno od tipa sistema pa je nujna še prisotnost Cas9, Csn2, tracrRNA in Cas4.

Glavna faktorja v procesu integracije vmesnika sta proteina Cas1 in Cas2, ki tvorita kompleks pri katerem se dimer Cas2 veže na dva dimera Cas1. V primeru mutacije na aktivnem mestu proteina Cas1, do integracije ne pride, torej je ta nujen za vstavitev vmesnika. Nasprotno pa Cas2 nukleazna aktivnost za proces ni nujna, vendar se protein Cas1 na CRISPR DNA preferenčno veže na od Cas2 odvisni način. Kompleks Cas1-Cas2 je potencialno odgovoren tudi za transport novega vmesnika do želenega mesta na CRISPR.

Najprej Cas1 zareže v zaporedje CRISPR. Na položaj in smer integracije pomembno vpliva palindromska narava številnih ponovitev, saj te tvorijo strukture v obliki križa. Te prepozna kompleks Cas1-Cas2 in so znane tarče za cepitev s strani proteina Cas1. Vmesnik se zatem veže na mesto zareze. Za integracijo je nujna prisotnost vsaj ene ponovitve, esencialni pa so tudi deli vodilnega zaporedja. Posledično se novi vmesniki vedno vežejo le na eno stran zaporedja, vendar obstajajo izjeme. Na integracijo torej vpliva tako zaporedje kot tudi tvorba sekundarnih struktur. Vodilnemu zaporedju bližnja ponovitev se najverjetneje loči na posamezni verigi in tako služi kot predloga za sintezo nove ponovitve.[5]

Izvor zaporedij CRISPR

Pri analizi skupkov specifičnih genov znotraj genoma arhej imenovanih otočki temne snovi so leta 2013 odkrili več otočkov, ki kodirajo za protein Cas1 in niso povezani z lokusom CRISPR. Prav tako so te regije obdane z dolgimi obrnjenimi ponovitvami in kratkimi usmerjenimi ponovitvami. Zaradi podobnosti s transpozoni so jih poimenovali kaspozoni. Opazili so tudi integrazno aktivnost, ki kaže močno preferenco za vezavo na tarčno mesto. Prišlo je tudi do podvojitve tarčnega mesta, ki je funkcijsko podoben tistim, ki so potrebni za vstavitev protovmesnika v lokus CRISPR. V obeh sistemih je funkcionalno tarčno mesto sestavljeno iz zaporedja, ki se podvoji ob integraciji tuje DNA in regije navzgor po zaporedju, ki določa točno mesto integracije. Na podlagi teh podobnosti se je razvila hipoteza o evolucijskem izvoru sistema CRISPR-Cas. K izvoru in evoluciji pa so prispevali tudi nekateri efektorski proteini.[2]

Reference

[1] F. J. M. Mojica, E. Soria, C. Diez-Villasenor, J. Gracia-Martinez: Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive from Foreign Genetic Elements. J. Mol. Evol., 2005 (60), 174-182.

[2] Y. Ishino, M. Krupovic, P. Forterre: History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. ASM, 2017.

[3] C. Pourcel, G. Salvignol, G. Vergnaud: CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology, 2015 (151), 653-663.

[4] A. Bolotin, B. Quinquis, A. Sorokin, S. D. Ehrlich: Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology, 2005 (151), 2551-2561.

[5] D. Rath, L. Amlinger, A. Rath, M. Lund: The CRISPR-Cas immune system: Biology, mechanisms and applications. Biochmie, 2015 (117), 119-128.