View source for Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

Of CO<sub>2</sub>urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO<sub>2</sub>urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO<sub>2</sub>) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO<sub>2</sub> in krčenjem naravnih ponorov CO<sub>2</sub>, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO<sub>2</sub> v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO<sub>2</sub> Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO<sub>2</sub> med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO<sub>2</sub> iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sinteznobiološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO<sub>2</sub> <sup>[1]</sup>.

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO<sub>2</sub>urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO<sub>2</sub> iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO<sub>2</sub> v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO<sub>2</sub> iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO<sub>2</sub> v industriji <sup>[1]</sup>.

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO<sub>2</sub> '''===

Za pripravo CO<sub>2</sub>-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, s sod. ''Quantitative analysis of an engineered CO<sub>2</sub>-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO<sub>2</sub> fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO<sub>2</sub>. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje <sup>[1]</sup>, <sup>[4]</sup>.

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO<sub>2</sub> iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti <sup>[1]</sup>.

Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO<sub>2</sub> v ogljikovo kislino oz. HCO<sub>3</sub><sup>-</sup>, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO<sub>2</sub> za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO<sub>2</sub> tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima ''E.coli'' lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize <sup>[1]</sup>, <sup>[4]</sup>.

==='''Učinkovitost izrabe CO<sub>2</sub> v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO<sub>2</sub>' (ang. ''CO<sub>2</sub> bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.<sub>600</sub>) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO<sub>2</sub> vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO<sub>2</sub> proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.<sub>600</sub> kakor v atmosferi brez dodanega CO<sub>2</sub> <sup>[1]</sup>. 

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO<sub>2</sub> so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.<sub>600</sub> celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO<sub>2</sub> in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.<sub>600</sub> korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.<sub>600</sub> stalna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.<sub>600</sub> ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.<sub>600</sub>. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.<sub>600</sub> in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, ''E.coli'' BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO<sub>2</sub>. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi <sup>[4]</sup>. Določili so, da je pripravljen sinteznobiološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO<sub>2</sub> <sup>[1]</sup>, <sup>[4]</sup>.

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO<sub>2</sub> in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO<sub>2</sub>, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO<sub>2</sub>, pH meter in sinteznobiološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja <sup>[1]</sup>.

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja <sup>[1]</sup>.

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob morebitnem izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče <sup>[1]</sup>.

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sinteznobiološki sistem za zmanjšanje izpustov CO<sub>2</sub>, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO<sub>2</sub> ne potrebuje sladkorja <sup>[4]</sup>, <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, s sod. ''Sugar Synthesis from CO<sub>2</sub> in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO<sub>2</sub> tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>