View source for OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov

Projekt OpenPlast je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen z veliko nagrado. Zasnovala ga je skupina Marburg, ki je želela pripraviti in optimizirati kloroplastne brezcelične sisteme različnih rastlinskih vrst, ki bi omogočili ''in vitro'' karakterizacijo genetskih delov [1]. 

Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:Marburg iGEM:Marburg].

Avtorica povzetka: Kim Glavič

= '''Problem''' =
 
Kmetijstvo se je pojavilo pred približno 10.000 leti in je predstavljalo velik korak v človeškem razvoju, saj je omogočilo, da se je človek za stalno naselil na določenem območju. Konstantno izboljševanje donosa poljščin, ki smo mu bili priča od zelene revolucije, pa se je v zadnjih letih ustavilo [1, 2]. Glede na naraščajoče število svetovnega prebivalstva in posledično potrebo po večjih količinah pridelkov na eni strani ter podnebne spremembe, ki predstavljajo enega največjih izzivov za kmetijstvo, saj prinašajo višje temperature, suše in poplave, na drugi strani, smo se znašli v situaciji, ko je večji donos poljščin nujen [1].
Eno izmed rešitev zgoraj omenjenega problema predstavljajo genetsko spremenjene poljščine, ki obetajo večje pridelke, odpornost proti mnogim biotskim in abiotskim stresorjem, večjo hranilno vrednost ter učinkovitejšo fiksacijo ogljika in dušika. Hitrost razvoja teh poljščin pa je bistveno prepočasna. Od odkritja do odobritve novih rastlinskih lastnosti v današnjem času namreč preteče med 10 in 15 let, od česar se za dokazovanje razvitih konceptov in optimizacijo genetskih konstruktov porabijo kar štiri leta [1]. 

= '''Cilj projekt'''a =

Skupina iz Nemčije je pripravila in optimizirala brezcelične ekstrakte kloroplastov različnih rastlinskih modelnih organizmov in industrijsko pomembnih poljščin, ki omogočajo skrajšanje časa trajanja rastlinskega sinteznobiološkega razvojnega cikla ter tako pospešijo genski inženiring poljščin. Brezcelični sistemi lahko namreč služijo za karakterizacijo genetskih delov, sledenje presnovnih poti in pregledovanje potencialnih antibiotikov [1].

= '''Izvedba''' =

== Izbira rastlin ==

Za delo so si izbrali tako rastlinske modelne organizme, kot tudi nekatere industrijsko pomembne poljščine.
 
Med modelne organizme, ki so jih uporabili spadajo: tobak (''Nicotiana tabacum''), špinača (''Spinacia oleracea''), navadni repnjakovec (''Arabidopsis thaliana'') in enocelična zelena alga ''Chlamydomonas reinhardtii''. 

Izbrane industrijsko pomembne poljščine pa so: koruza (''Zea mays B73''), pšenica (''Triticum aestivum''), riž (''Oryza sativa''), soja (''Glycine max''), repna ogrščica (''Brassica napus'') in paradižnik (''Solanum lycopersicum'') [1].

== Priprava kloroplastnih ekstraktov ==

Rastline so gojili v rastlinjakih in rastnih komorah ter jih pred izolacijo kloroplastov inkubirali v temi 24 ur (oljna ogrščica in soja) oziroma 48 ur (tobak, pšenica, koruza, riž in paradižnik). Zaradi onemogočene fotosinteze, rastline v tem času zaloge škroba pretvorijo nazaj v sladkorje, ki jih uporabijo v anabolizmu. Tako so zmanjšali vsebnost škroba, ki je sicer oteževala izolacijo nepoškodovanih kloroplastov. Vsi nadaljnji koraki izolacije kloroplastov in priprave ekstraktov so potekali v hladni sobi pri 4 °C [1, 3].

Na dan izolacije kloroplastov so nabrali liste rastlin, jim izrezali listne žile, temeljito oprali in 300 gramov listne mase narezali na majhne koščke. Sledila je homogenizacija s komericalnim mešalnikom, pri kateri so glede na vrsto rastline so uporabili različna razmerja listna masa:pufer [1, 3].

Listni homogenat so filtrirali in nato iz raztopine izolirali kloroplaste s centrifugiranjem. Ti so se med centrifugiranjem posedli na dno centrifugirke. Supernatante so zavrgli, kloroplastne pelete pa resuspendirali [1, 3].

Nepoškodovane kloroplaste so od poškodovanih ločili z gradientnim centrifugiranjem. V ta namen so uporabili nekontinuirne gradiente Percoll-a ali saharoze. Po centrifugiranju sta v gradientu nastala dva pasova: prvi  je vseboval poškodovane, drugi pa intaktne kloroplaste. Slednje so s pipeto previdno odstranili in sprali [1, 3].

Sledila je liza kloroplastov s pomočjo igle. Raztopino kloroplastov so 24-krat spustili skozi iglo, kar je povzročilo poškodbe membran kloroplastov in omogočilo sprostitev njihove vsebine v raztopino. Da so ohranili aktivnost ribosomov liziranih kloroplastov so raztopini dodali še 0,1 mM GTP in 0,04 mM raztopino aminokislin [1, 3].

== Priprava konstruktov ==

V okviru projekta so zasnovali dva tipa naprav:

'''T7 universal test construct''' - naprava za zaznavanje aktivnosti v brezceličnem sistemu kateregakoli organizma. Omogoča izražanje luciferaze NanoLuc, katere nivo izmerjene luminiscence odraža aktivnost brezceličnega sistema. V osnovi je sestavljena iz promotorja T7, 5'UTR zaporedja gena 10 iz bakteriofaga T7, kodirajočega zaporedja za luciferazo NanoLuc in 3'UTR virusa mozaika tobaka. Tekom optimizacije izražanja reporterskega gena v brezceličnih sistemih so omenjene regulatorne dele prilagajali glede na dobljene rezultate [1].

'''Merilne naprave''' – naprave za visokozmogliivostno karakterizacijo regulatornih delov. Od prve naprave se ta razlikuje po tem, da vsebuje še kaseto v nasprotni orientaciji. Ta omogoča izražanje gena, ki zapisuje za luciferazo Firefly. Regulatornih delov te kasete med poskusi niso spreminjali, saj so lahko tako izražanje gena za luciferazo NanoLuc normalizirali glede na izražanje gena za luciferazo Firefly in s tem zmanjšali vpliv razlik med serijami ekstraktov na rezultate [1].

= '''Rezultati''' =

Uspešno so pripravili in optimizirali visoko učinkovite brezcelične kloroplastne ekstrakte tobaka in špinače ter vzpostavili prvi delujoči brezcelični kloroplastni ekstrakt pšenice [1].

 
== Optimizacija ==

V prvih poskusih ni prišlo do visoke stopnje izražanja reporterskega gena, so optimizirali tako pripravo ekstraktov kot tudi sestavo konstruktov [1].


'''Koncentracija kalija in magnezija:'''

Optimizacija koncentracij kalija in magnezija je zelo pomembna, saj se potrebe po teh lahko med rastlinskimi vrstami močno razlikujejo, kar pa ima velik vpliv na raven izražanja. S sistematičnim spreminjanjem koncentracij so določili optimalne koncentracije kalija in magnezija za posamezne rastlinske vrste [1].


'''Koncentracija DNA:'''

Pri optimizaciji koncentracije dodane DNA so ugotovili, da stopnja izražanja reporterskega gena z višanjem koncentracije DNA razmeroma hitro doseže plato [1].


'''Volumen reakcije:'''

Prvotne eksperimente so izvedli v 10-mikroliterskih reakcijah, saj so tako zagotovili zadostno količino vseh reagentov in zmanjšali napake pri pipetiranju. Pri optimizaciji so volumne reakcij zmanjšali na 4 mikrolitre. S ciljem znižanja količine potrebnih kloroplastnih ekstraktov in ostalih reagentov so volumne reakcij želeli zmanjšati. Najmanjši končni volumen reakcije, ki so ga dosegli je bil 4 μl. Za nadaljnje zmanjšanje volumnov pa bi bila potrebna uporaba ustreznih naprav za pipetiranje majhnih volumnov [1].


'''Raba kodona:'''

Stopnja izražanja enakega reporterskega gena, optimiziranega za izražanje v različnih šasijah, se je razlikovala. V primeru uporabe zapisa za luciferazo NanoLuc z rabo kodona optimizirano za zelene alge ''Chlamydomonas reinhardtii'' je bila luminiscenca kloroplastnih ekstraktov tobaka presenetljivo višja, kot v primeru optimizacije rabe kodona za tobak. Razlog za nepričakovan rezultat bi lahko bil nastanek sekundarnih struktur na 5'-koncu prepisa optimiziranega za tobak, ki bi oteževale prevajanje [1].


'''Linearna DNA:'''

Pristop z uporabo linearne matrične DNA je časovno ugodnejši od priprave plazmidov, a obstaja večja verjetnost neželene razgradnje DNA z nukleazami prisotnimi v ekstraktu. Rezultati so pokazali višjo stopnjo izražanja reporterskega gena iz linearne kot iz plazmidne DNA. Razlog bi lahko bila prisotnost superzvite oblike plazmida, ki je za transkripcijo manj dostopna [1].

Ker se je uporaba linearnih matričnih DNA izkazala za učinkovito so uvideli možnost izboljšave protokola dela, ki bi omogočil visokozmogljivostno testiranje regulatornih delov v le 7 urah. Posamezne dele bi združili v napravo z metodo Golden Gate, nastal konstrukt pomnožili s PCR in amplikone direktno uporabili za izražanje reporterskega gena v brezceličnih sistemih kloroplastov [1].

== Karakterizacija delov ==

Glede na uporabljen regulatorni element, so opazili širok razpon ravni izražanja reporterskega gena. Torej so uspeli doseči zastavljen cilj – uporaba brezceličnih sistemov za karakterizacijo genetskih konstruktov ''in vitro'' [1].


== ''In vivo'' poskusi ==

Želeli so pokazati, da so meritve, opravljene na brezceličnih sistemih, reprezentativne in primerljive s podatki pridobljenimi s poskusi ''in vivo''. Kloroplaste tobaka so transformirali s petimi različnimi konstrukti, a zaradi časovnih omejitev niso pridobili popolnoma homoplazemskih rastlin, ki bi jih lahko uporabili za reprezentativno primerjavo s pripravljenimi kloroplastnimi ekstrakti. Kljub temu pa so uspeli pridobiti heteroplazemske kaluse, v katerih je prišlo do izražanja luciferaze NanoLuc [1].

= '''Obeti''' =


V obsegu projekta OpenPlast so uspeli razviti brezcelične sisteme kloroplastov tobaka, špinače in pšenice [1].

V prihodnosti bi bilo tehnologijo smiselno razširiti še na druge industrijsko pomembne poljščine kot so banane, bambus in sladkorni trs. Poleg tega pa bi bil potreben tudi razvoj novih genetskih delov za uporabo tako v najrazličnejših rastlinskih vrstah. Na primer za izražanje genov v kloroplastih riža se trenutno uporablja le en promotor, ki pa ni dovolj močan, da bi omogočal zadostno izražanje transgena. Problema bi se lahko lotili z uporabo razvitih brezceličnih sistemov, s katerimi bi različne dele karakterizirali in optimalne izbrali za eksperimente ''in vivo'' [1].


= '''Viri''' =

[1]     Team:Marburg - 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:Marburg (pridobljeno 2. 5. 2022).

[2]	P. Grassini, K. M. Eskridge, K. G. Cassman: Distinguishing between yield advances and yield plateaus in historical crop production trends. Nat. Commun. 2013, 4.

[3]     D. G. Whitehouse, A. L. Moore: Isolation and purification of functionally intact chloroplasts from leaf tissue and leaf tissue protoplasts. Methods Mol. Biol. 1993, 19, str. 123–131.