Openplast

Projekt OpenPlast je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen z veliko nagrado. Zasnovala ga je skupina Marburg, ki je želela pripraviti in optimizirati kloroplastne brezcelične sisteme različnih rastlinskih vrst, ki bi omogočili in vitro karakterizacijo genetskih delov [1].

Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: iGEM:Marburg.

Problem

Kmetijstvo se je pojavilo pred približno 10.000 leti in je pomenilo velik korak v človeškem razvoju, saj je omogočilo, da se je človek za stalno naselil na določenem območju. Konstantno izboljševanje donosa poljščin, ki smo mu bili priča od zelene revolucije, se je v zadnjih letih ustavilo. Glede na naraščajoče število svetovnega prebivalstva in posledično potrebo po večjih količinah pridelkov na eni strani ter podnebne spremembe, ki predstavljajo enega največjih izzivov za kmetijstvo, saj prinašajo višje temperature, suše in poplave, na drugi strani, smo se znašli v situaciji, ko je večji donos poljščin nujen. Eno izmed rešitev zgoraj omenjenega problema predstavljajo genetsko spremenjene poljščine, ki obetajo večje pridelke, odpornost proti mnogim biotskim in abiotskim stresorjem, večjo hranilno vrednost ter učinkovitejšo fiksacijo ogljika in dušika. Hitrost razvoja teh poljščin pa je bistveno prepočasna. Od odkritja do odobritve novih rastlinskih lastnosti v današnjem času namreč preteče med 10 in 15 let, od česar se za dokazovanje razvitih konceptov in optimizacijo genetskih konstruktov porabijo kar štiri leta.

Cilj projekta

Skupina iz Nemčije je pripravila in optimizirala brezcelične ekstrakte kloroplastov različnih rastlinskih modelnih organizmov in industrijsko pomembnih poljščin, ki omogočajo skrajšanje časa trajanja rastlinskega sinteznobiološkega razvojnega cikla ter tako pospešijo genski inženiring poljščin. Brezcelični sistemi namreč služijo kot prototipi za preizkušanje genetskih delov, sledenje presnovnih poti in pregledovanje potencialnih antibiotikov.

Izvedba

Izbira rastlin

Za delo so si izbrali tako rastlinske modelne organizme, kot tudi nekatere industrijsko pomembne poljščine. Med modelne organizme, ki so jih uporabili spadajo: tobak (Nicotiana tabacum), špinača (Spinacia oleracea), navadni repnjakovec (Arabidopsis thaliana) in enocelična zelena alga Chlamydomonas reinhardtii. Izbrane industrijsko pomembne poljščine pa so: koruza (Zea mays B73), pšenica (Triticum aestivum), riž (Oryza sativa), soja (Glycine max), repna ogrščica (Brassica napus) in paradižnik (Solanum lycopersicum).

Priprava kloroplastnih ekstraktov

Rastline so gojili v rastlinjakih in rastnih komorah ter jih pred izolacijo kloroplastov inkubirali v temi 24 ur (oljna ogrščica in soja) oziroma 48 ur (tobak, pšenica, koruza, riž in paradižnik). Zaradi onemogočene fotosinteze rastline v tem času zaloge škroba pretvorijo nazaj v sladkorje, ki jih uporabijo v anabolizmu. Tako so zmanjšali vsebnost škroba, ki je sicer oteževala izolacijo nepoškodovanih kloroplastov. Vsi nadaljnji koraki izolacije kloroplastov in priprave ekstraktov so potekali v hladni sobi pri 4 °C.

Na dan izolacije kloroplastov so nabrali liste rastlin, jim izrezali listne žile, temeljito oprali in 300 gramov listne mase narezali na majhne koščke. Sledila je homogenizacija s komericalnim mešalnikom iz nerjavečega jekla. Glede na vrsto rastline so uporabili različna razmerja listna masa:pufer za homogenizacijo. Za tobak, repno ogrščico, sojo in špinačo je razmerje znašalo 1:3 dele pufra, za pšenico, riž, paradižnik in koruzo pa 1:4.

Listni homogenat so filtrirali in nato iz raztopine izolirali kloroplaste s centrifugiranjem. Ti so se med centrifugiranjem posedli na dno centrifugirke. Supernatante so zavrgli, kloroplastne pelete pa resuspendirali.

Nepoškodovane kloroplaste so od poškodovanih ločili z gradientnim centrifugiranjem. V ta namen so uporabili nekontinuirne gradiente Percoll-a ali saharoze. Po centrifugiranju sta v gradientu nastala dva pasova: prvi je vseboval poškodovane, drugi pa intaktne kloroplaste. Slednje so previdno odstranili s pipeto in sprali.

Sledila je liza kloroplastov s pomočjo igle. Raztopino kloroplastov so 24-krat spustili skozi iglo, kar je povzročilo poškodbe membran kloroplastov in omogočilo sprostitev njihove vsebine v raztopino. Da so ohranili aktivnost ribosomov liziranih kloroplastov so raztopini dodali še 0,1 mM GTP in 0,04 mM raztopino aminokislin.