P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:Bielefeld-CeBiTec

Avtorica povzetka: Tina Logonder

Problem odlagališč kemičnih orožij

V Nemčiji se po celotni državi nahaja preko 200 odlagališč kemičnih orožij iz obeh svetovnih vojn. Ker so bila orožja odvržena nekontrolirano, lahko pride do uhajanja strupov v naravo, kar predstavlja grožnjo za zastrupitev ljudi in okolja. Skupina nemških podiplomskih študentov Bielefeld-CeBiTec je na tekmovanju iGEM 2021 predstavila rešitev tega problema – detekcija bojnih strupov s pomočjo rastlin.

Cilj projekta

Ideja je pripraviti rastline, ki bi se ob prisotnosti bojnih strupov v tleh obarvale iz zelene v rdečo. V okviru projekta so razvili specifične receptorje za bojne strupe, ki ob vezavi tarčne molekule sprožijo signalno kaskada. Ta pa vodi v izražanje reporterskih proteinov, kar privede do sinteze rdečega barvila, ki liste rastline obarva rdeče. To bi zagotovilo poceni in prilagodljiv detekcijski sistem za lokalizacijo ostankov kemičnih strupov. Sledila bi odstranitev strupov iz okolja ali pa morebitno zavarovanje kontaminiranega območja.

Sintetična signalna kaskada

Bakterijska kemotaksa – bistvo P.L.A.N.T.

Delno sintetična signalna kaskada za detektiranje bojnih strupov temelji na sistemu, ki omogoča zaznavanje okolijskih pogojev. Mehanizem je dobro ohranjen pri različnih vrstah in ga najdemo tako pri rastlinah kot pri bakterijah. Izbrali so sistem iz E. coli, ki je vključen v kemotaks o. Prvi korak kompleksne signalizacije je vezava liganda , na specifični receptor PBP (periplazemski vezavni protein) med katere spada tudi RBP (riboza vezavni protein). Po vezavi liganda na RBP pride do konformacijske spremembe, ki omogoči interakcijo s transmembranskim receptorjem Trg [2]. Citoplazemski del receptorja služi kot ogrodje za signalni kompleks receptor-kinaza CheA. Vezavo kinaze olajša konformacijska sprememba ob vezavi RBP na Trg [3]. Po vezavi liganda se aktivnost kinaze zniža, kar posledično zavira aktivnost CheB in CheY, ki sta regulatorja odziva [3]. Metilaza CheB je antagonist metilacijskega encima CheR. CheR metilira Trg, posledično je ta manj odziven na vezavo liganda. CheB zavrne to reakcijo in tako poveča občutljivost na ligand. Fosforilirani CheY se poveže z motornim proteinom bička in povzroči spremembo smeri gibanja bakterije [3]. Po vezavi liganda inhibicija aktivnosti CheB in CheY omogoči stabilno plavanje vzdolž naraščajočega gradienta atraktanta.

Baumgartner in sodelavci so leta 1994 konstruirali fuzijski protein Trz [4]. Sestavljata ga periplazemska in transmembranska domena receptorja Trg povezani s citoplazemskim delom histidin kinaze EnvZ preko domene HAMP [4], [5].Tak fuzijski protein je sposoben prepoznati RBP z vezanim ligandom in po interakciji z RBP fosforilirati transkripcijski faktor OmpR. Posledično se inducira izražanje genov pod kontrolo promotorja OmpC, ki ga aktivira fosforiliran OmpR [6].Leta 2011 je skupini Medford ta pristop prenesla z bakterij na rastline [7].

Receptorji za bojne strupe

Ključen korak do funkcionalnega detekcijskega sistema razpadnih produktov kemičnih orožij je razvoj receptorja, ki specifično veže tarčno molekulo. Kot izhodni protein so si izbrali RBP (BBa_K3900001). Z računalniškimi metodami so ustvarili funkcionalne in specifične receptorje, ki vežejo kemičnim orožjem podobne, saj bi bilo delo z dejanskimi spojinami kemičnih orožij preveč nevarno in toksično. Namesto bojnega plina iperita (gorčični plin) so uporabili njegov razpadni produkt tiodiglikol (TDG), namesto živčnega strupa sarina pa sledeče razpadne produkte: diizopropil metilfosfonat (DIMP), dietil metilfosfonat (DEMP) in metilfosfonsko kislino (MPA). Benzentrikarboksilna kislina (BTCA) je zaradi podobnosti v tridimenzionalni strukturi nadomestila uporabo strupenega eksploziva 2,4,6-trinitrutoluena (TNT). Za načrtovanje so uporabili program Rosseto v kombinaciji z EvoDock, ki temelji na evolucijskem algoritumu, kar je povečalo učinkovitost procesa načrtovanja.

Reporter RUBY (BBa_K3900028)

Želeli so, da bi bil izhodni signal sistema viden s prostim očesom, in sicer kot obarvanje listov rastlin iz zelene v rdečo. Listi rastlin so večinoma obarvani zeleno, lahko pa rastline sintetizirajo tudi veliko različnih barvitih pigmentov. Za vzpostavitev novega reporterskega sistema RUBY so si izbrali pigment betacianin (betalain), ki je najbolj znan po tem, da daje pesi intenzivno rdečo barvo [7], [8]. Za sintezo betalaina iz tirozina so potrebni trije encimi: (citokrom P450, DODAα in glikozil transferaza) [9]. Kodirani so v enem odprtem bralnem okviru in ločeni s peptidi 2A, kar omogoča samocepitev fuzijskega proteina.

Vektorji signalne kaskade

Escherichia coli

Uporabljene biokocke:

• pBAD – arabinozni promotor - BBa_K206000

• receptor za TNT (računalniško zmodeliran) - BBa_K216003

• acaC-Pbad – promoter pBAD z genom za represor araC - BBa_K808000

• fuzijski protein Trz - BBa_K216004

• dvojni terminator (B0012-B0011) - BBa_B0014

• OmpC promotor - BBa_R0082

• GFP - BBa_E0040

• terminator T1 - BBa_K731722

• gen za odpornost na kloramfenikol - BBa_P1003

Uporabili so vektor pSB1C3. Gena na Trz in receptor ssTNT sta bila pod kontrolo inducibilnega arabinoznega promotorja s tem so zmanjšali stres v zgodnjih fazah rasti in verjetnost tvorbe inkluzijskih telesc. Gen za reporterski protein GFP je bil pod kontrolo inducibilnega promotorja OmpC, ki ga aktivira OmpR. OmpR se nativno pojavlja v E. coli, zato zapisa zanj ni bilo potrebno vključiti v vektor.

Nicotiana benthamiana

Signalno kaskado za testiranje v rastlinskem sistemu so razdelili na dva plazmida pMAP, oba sta vsebovala gen za odpornost na kanamicin.

Biokocke prvega plazmida:

• promotor CaMV 35S - BBa_K3900015

• receptor za TNT (optimiziran z rastline) - BBa_K3900011

• terminator NOS BBa_K788001

• transmembranski fuzijski protein AtFLS-Trg-PhoR - BBa_K3900008

• rastlinski promotor NOS - BBa_K3900009

Receptor za TNT je pod kontrolo močnega promotorja CaMV 35S (virus mozaika cvetače). Fuzijski protein AtFLS-Trg-PhoR je pod kontrolo promotorja NOS. AtFLS je membranski lokalizacijski signal, Trg je že prej omenjeni bakterijski transmembranski receptor, ki sodeluje v procesu kemotakse, PhoR je histidinska kinaza, ki deluje enako kot EnvZ. Gre le za modifikacijo sistema prilagojenega za delovanje v rastlinah.

Biokocke drugega plazmida:

• FMV promoter - BBa_K3900012

• transkripcijski faktor PhoB-VP64 - BBa_K3900013

• terminator NOS - BBa_K788001

• promotor PlantPho - BBa_K3900014

• reporter RUBY - BBa_K3900028

• terminator G7 - BBa_P10402

Gen za transkripcijki faktor PhoB-VP64 je pod kontrolo virusnega promotorja FMV, gen za reporter RUBY je pod kontrolo inducibilnega promotorja PlantPho.

Bakterijski testni sistem

Za izvedbo začetnih testov signalne kaskade in de novo pripravljenih receptorjev so uporabili bakterijo Escherichia coli. Izhodni signal je predstavljala fluorescenca reporterja GFP.

Testiranje signalne kaskade

Bakterijske seve DH5α E. coli so transformirali z vektorjem signalne kaskade. Vendar gen za receptor za TNT na vektorju ni imel zapisa za signalni periplazemski lokalizacijski peptid. Zato so preizkusili ali bi se signalna pot aktivirala z dodatkom riboze, ki bi se vezala na endogeni bakterijski RBP. Peleti bakterijskih kultur, ki so jim dodali arabinozo (indukcija izražanja Trz) in ribozo (vezava na RBP) so se uspešno obarvali zelenkasto. Fluorescenco so kvantificirali s konfokalnim laserskim skenirnim mikroskopom (CLSM). Izkazalo se je, da dodatek arabinoze in riboze vodi do najvišje intenzitete fluorescnce. Vendar rezultati niso statistično signifikantni, saj je šlo razmeroma nizke intentzitete fluorescence, kar je lahko posledica nizke stopnje izražanja endogenega RBP

Prekomerno izražanje receptorja

Naslednji korak je bil poskus prekomernega izražanje RBP za povečanje začetnega dražljaja, kar bi posledično vodilo do višjega izhodnega signala. Izvedli so kotransformacijo seva E. coli BL21(DE3), s plazmidom s signalno kaskado in dodatnim plazmidom pJOE, ki je vseboval gen za RBP pod kontrolo promotorja T7 in gen za odpornost proti ampicilinu. Pokazali so, da se izhodni signal poveča s prekomernim izražanjem RBP, kar kaže, da je endogeno izražen RBP ozko grlo v signalni kaskadi.

Testiranje računalniško zasnovanih receptorjev

Sledilo je testiraje aktivacije signalne kaskade z uporabo računalniško zasnovanimi receptorji. Celice seva E. coli BL21(DE3) so kotransformirali s plazmidom signalne kaskade in dodatnim plazmidom z zapisom za receptor za BTCA. Pri dodatku BTCA in arabinoze je prišlo do signifikantnega povečanja fluorescence v primerjavi s preostalimi vzorci (negativna kontrola, dodatek arabinoze, dodatek BTCA).

Sledila je primerjava endogenega receptorja in računalniško zasnovanega receptorja. Rezultati so pokazali specifično vezavo BTCA na računalniško zasnovani receptor, saj je bil signal intenzivnejši v primerjavi z vzorcema, pri katerih so signalno kaskado inducirali z vezavo riboze na receptor BTCA oziroma BTCA na RBP.

Rastlinski testni sistem

Agroinfiltiracija

Agrofiltracija je metoda, pri kateri agrobakterije z brizgo brez igle vbrizgamo v spodnjo stran listov 4–6 tednov starih rastlin. Izražanje vnesenih genov je predvidoma vidno po dveh dneh. V primerjavi s stabilno transformacijo rastlin je agroinfiltracija enostavna metoda za zelo hitro testiranje konstruktov [10], [11]. Zaradi tankih, a razmeroma velikih listov je rastlina tobaka (Nicotiana benthamiana) izjemno primerna za to metodo.

Testiranje reporterja RUBY

Za testiranje funkcionalnosti reporterja RUBY so [8] infiltrirali liste rastline tobaka z agrobakterijami, ki so nosile plazmid pHDE z genom za reporter RUBY pod nadzorom konstitutivnega promotorja CaMV 35S (BBa_K3900049). Dva dni po prehodni transformaciji se je barva listov jasno spremenila v rdečo, vidno obarvani so ostali 9 dni, kar potrjuje da pigmenti v rastlini ostanejo dolgo stabilni. Poleg tega se je RUBY izražal tudi pod kontrolo inducibilnega promotorja LexA (BBa_K3900048), ki ga aktivira estradiol. Reporter RUBY je torej primeren kot inducibilni reporterski sistem v rastlinah.

Testiranje signalne kaskade

Ker so signalno kaskado porazdelili na dva plazmida je potrebno liste tobaka kontransformirati z obema. Tobačne rastline so kotransformirali s plazmidom pK7FWG2, ki nosi EGFP (BBa_K1875003) in reporterskim plazmidom RUBY. S CLSM so dokazali izražanje tako RUBY kot tudi EGFP v infiltriranih mestih, in tem potrdili kotransformacijo z agroinfiltracijo.

Za preverjanje funkcionalnosti signalne kaskade so z agroinfiltracijo transformirali liste tobaka z zgoraj opisanima vektorjema pMAP. Na enem izmed teh vektorjev je sicer zapis za receptor za TNT. Ker je delo s TNT prenevarno so uporabili njegov nadomestek BTCA. Z računalniško analizo so pokazali, da bi se tudi BTCA lahko vezal v receptor za TNT in pri tem tvoril celo več vodikovih vezi koz TNT. Poleg tega so poskusi s hidrokulturami so pokazali, da rastline tobaka absorbirajo BTCA. Prisotnost BTCA v celicah so dokazali z uporabo GC/MS.

Po več dneh inkubacije se listi niso obarvali rdeče, torej signalna kaskada in indukcija izražanja RUBY nista bila aktivirana. Razlogov za to je lahko več: neuspešna kontransformacija, interakcija ligand-receptor ni dovolj močna, lahko pride do težav pri prenosu signala ali aktivaciji reporterja. Zaradi pomanjkanja časa teh domnev niso uspeli preveriti.

Prihodnost in izboljšave

V prihodnje bi lahko v rastlinah preizkusili delovanje računalniško zasnovanega receptorja BTCA, katerega delovanje so potrdili v bakterijskem testnem sistemu. Če bi jih rastline uspelo razviti za zaznavanje kemičnih orožij, bi se kasneje lahko ta modificiral in bi se ga lahko uporabljalo za detektiranje tudi drugih snovi, ki onesnažujejo okolje. Moramo se zavedati tudi, da je trenutno uporaba takih rastlin za lokaliziranje preostalih vojnih strupov v tleh še prepovedana z zakonom, saj gre za gensko spremenjene organizme, ki jih v EU še ni dovoljeno gojiti. 

Viri

[1] “Team:Bielefeld - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:Bielefeld-CeBiTec. [Accessed: 09-Apr-2022].

[2] M. J. Borrok, Y. Zhu, K. T. Forest, and L. L. Kiessling, “Structure-based design of a periplasmic binding protein antagonist that prevents domain closure,” ACS Chem. Biol., vol. 4, no. 6, pp. 447–456, Jun. 2009, doi: 10.1021/CB900021Q.

[3] J. J. Falke, R. B. Bass, S. L. Butler, S. A. Chervitz, and M. A. Danielson, “The two-component signaling pathway of bacterial chemotaxis: a molecular view of signal transduction by receptors, kinases, and adaptation enzymes,” Annu. Rev. Cell Dev. Biol., vol. 13, pp. 457–512, 1997, doi: 10.1146/ANNUREV.CELLBIO.13.1.457.

[4] J. W. Baumgartner, C. Kim, R. E. Brissette, M. Inouye, C. Park, and G. L. Hazelbauer, “Transmembrane signalling by a hybrid protein: Communication from the domain of chemoreceptor Trg that recognizes sugar-binding proteins to the kinase/phosphatase domain of osmosensor EnvZ,” J. Bacteriol., vol. 176, no. 4, pp. 1157–1163, 1994, doi: 10.1128/jb.176.4.1157-1163.1994.

[5] M. Hulko et al., “The HAMP Domain Structure Implies Helix Rotation in Transmembrane Signaling,” Cell, vol. 126, no. 5, pp. 929–940, Sep. 2006, doi: 10.1016/J.CELL.2006.06.058.

[6] D. Tavares, A. Reimer, S. Roy, A. Joublin, V. Sentchilo, and J. R. van der Meer, “Computational redesign of the Escherichia coli ribose-binding protein ligand binding pocket for 1,3-cyclohexanediol and cyclohexanol,” Sci. Rep., vol. 9, no. 1, Dec. 2019, doi: 10.1038/S41598-019-53507-5.

[7] M. S. Antunes et al., “Programmable Ligand Detection System in Plants through a Synthetic Signal Transduction Pathway,” PLoS One, vol. 6, no. 1, 2011, doi: 10.1371/JOURNAL.PONE.0016292.

[8] Y. Tanaka, N. Sasaki, and A. Ohmiya, “Biosynthesis of plant pigments: anthocyanins, betalains and carotenoids,” Plant J., vol. 54, no. 4, pp. 733–749, May 2008, doi: 10.1111/J.1365-313X.2008.03447.X.

[9] Y. He, T. Zhang, H. Sun, H. Zhan, and Y. Zhao, “A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation,” Hortic. Res., vol. 7, no. 1, Dec. 2020, doi: 10.1038/S41438-020-00390-1.

[10] H.-H. Hwang, M. Yu, and E.-M. Lai, “Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications,” Arab. B., vol. 15, p. e0186, Jan. 2017, doi: 10.1199/TAB.0186.

[11] J. Bally et al., “The rise and rise of nicotiana benthamiana: A plant for all reasons,” Annu. Rev. Phytopathol., vol. 56, pp. 405–426, 2018, doi: 10.1146/annurev-phyto-080417-050141.