View source for PANTIDE - nov kmetijski sistem, ki ciljano uničuje določene škodljivce

NCTU_Formosa: PANTIDE – A new agricultural system that eliminates targeted pests
http://2016.igem.org/Team:NCTU_Formosa

== UVOD ==
Učinkovit nadzor škodljivcev je že od nekdaj glavna težava modernega kmetijstva. Z naraščanjem svetovne populacije se povečujejo tudi potrebe po višji kmetijski proizvodnji, ki bo uspela zagotoviti ustrezne količine hrane. V današnjem času večina kmetov po svetu za zatiranje škodljivcev uporablja kemične pesticide, ker ti predstavljajo najpriročnejši in najučinkovitejši način nadzora škodljivcev. Vendar pa imajo zaradi povečane uporabe konvencionalni pesticidi negativno vplivajo na oporečenost hrane, zdravje kmetov, onesnaževanje zemlje in vode ter neposredno povzročajo pojavljanje na pesticide odpornih škodljivcev.

== PROJEKT ==
Zaradi omenjene problematike je skupina NCTU_Formosa razvila popolnoma nov kmetovalni sistem, ki s kombinacijo sintezne biologije, informatike in inžinirstva kmetom omogoča varno, okolju prijazno in nenaporno avtomatizirano kmetovanje. Kmetovalni sistem sestoji iz daljinsko vodene fizične naprave, ki s številnimi detektorji in avtomatskim škropilnikom omogoča nadziranje stanja kmetijske površine v realnem času, in bioinsekticida PANTIDE, ki je naraven, okolju prijazen, varen, biorazgradljiv in dolgotrajno specifičen za določene rede insektov predvsem pa nenevaren za čebele.

=== BIOINSEKTICID PANTIDE ===
Pajki predstavljajo eno izmed najuspešnejših kopenskih strupenih bitij, ki so v obdobju 300 milijonov let evolucije razvili niz kompleksinih molekul toksinov [1]. Njihov strup je mešanica več stotih komponent, zato se je skupina odločila, da bo tudi njihov pesticid mešanica pajčjih toksinov. Zaradi širokega nabora toksinskih molekul je skupina najprej za izbiro kandidatnih toksinov izvedla organiziran pregled po podatkovnih bazah AnachoServer in UniProt. Kandidatne toksine so izbrali glede na ustrezanje kriterijem, da so:
*netoksični za sesalce, kar je potrjeno z eksperimenti na miših
*imajo številne reference, kar dodatno potrdi podatke o izvoru, strukturi in mehanizmu
*nimajo več kot štirih disulfidnih vezi zaradi izražanja v E. coli
*nimajo antibiotične aktivnosti
*da so bile že izvedene študije oralnega vnosa pri določenih vrstah
Na ta način so izbrali tri toksine, ki delujejo na napetostne ionske kanalčke insektov in zato pri žuželkah povzročijo paralizo: 
*'''ω-heksatoksin-Hva1a (Hv1a)''', ki izvira iz vrste ''Hadronyche versuta'' in deluje rede ''Lepidoptera'' (metulji), ''Diptera'' (dvokrilci), ''Coleoptera'' (hrošči) in ''Dictyoptera'' [2].  
*'''µ-segestritoksin-Sf1a (Sf1a)''', ki izvira iz vrste ''Segestria florentina'' in deluje na redova ''Lepidoptera'' in ''Diptera'' [3].  
*'''oralno aktiven insekticidni peptid (OAIP)''', ki izvira iz vrste ''Selenotypus plumipes'' in deluje na redova ''Lepidoptera'' in ''Coleoptera''.
Izbrani toksini spadajo v široko skupino kratkih peptidov z disufidnimi vezmi. Večina teh toksinskih peptidov ima strukturni motiv ICK (Inhibitor Cysteine Knot), ki jim zagotovi dobro stabilnost proteinske strukture in toksičnost. Navedeni toksin Hv1a je stabilen v temperaturnem območju od -20 °C do 75 °C ter pH območju med 1 in 8, hkrati pa je odporen na razgradnjo s proteazo K [4].   
Ker pa toksini pajkov normalno vstopijo v hemolimfo žuželk in nato delujejo v centralnem ali perifernem živčnem sistemu, jih je večina ponavadi neučinkovitih ali vsaj izrazito manj učinkovitih, če jih žuželka zaužije. Zato je skupina za povečanje oralne toksičnosti izbranih toksinov, te pripravila v obliki fuzijskih proteinov [5]. Pri tem so zaporedje izbranega toksina povezali preko trialaninskega linkerja z lektinom iz zvončka (''Galanthus nivalis''), ki je odporen na proteolizo, prepozna glikoproteine epitelijskih celic črevesja in omogoči prehod fuzijskih proteinov v hemolimfo preko transcitoze [6].

Tako je skupina pripravila naravni bioinsekticid, ki je okolju prijazen, varen, biorazgradljiv in specifičen za določene vrste žuželk. Poleg tega pa bodo škodljivci zelo težko razvili odpornost nanj, ker ne le da so tarče od natrija in kalcija odvisni napetostni kanalčki, ki evolucijsko malo mutirajo, ampak gre tudi za mešanico treh različnih toksinov.

== NAPRAVA ==
Naprava je avtomatiziran sistem, ki omogoča detekcijo in eliminacijo škodljivcev. Izdelali so insektno škatlo, ki je sestavljena iz štirih delov: zunanjega ogrodja, ki zaščiti strojno opremo in ima štiri kanale za vstop škodljivcev. Vsak kanal ima po dva izvora in sprejemnika infrardeče LED svetlobe za natančno štetje žuželk in vodi do posode s feromonsko vabo. Ta ima obliko narobe obrnjene piramide, da omogoči nanos dveh slojev PBAN (pheromone biosynthesis activation neuropeptide), hkrati pa prepreči, da bi škodljivci ušli iz nje. Glede na delovanje pa je naprava sestavljena iz treh delov: detektorja, kontrolerja in uporabnika. 

=== DETEKTOR ===
Znotraj detektorja se nahaja PBAN feromonska vaba, ki skozi štiri kanale v katerih svetijo snopi infrardeče svetlobe v napravo privabi določene vrste žuželk in zato omogoči njihovo štetje. Poleg tega pa je detektor opremljen tudi s higrometrom, termometrom, barometrom, merilnikom dežja in senzorji za UV, CO2, vlažnost prsti ter osvetljenost. Detektor je preko WiFi-ja povezan s strežnikom, ki zbrane podatke obdeluje in shranjuje, ter z mobilno aplikacijo, ki omogoči spremljanje števila škodljivcev in stanja na kmetijski površini.

=== KONTROLER ===
Kontroler je sestavljen iz vezja različnih čipov in omogoča izmenjavo podatkov preko sistema IoT (internet of things). Sprejema podatke detektorja in senzorjev, jih obdela, prevede v ustrezno obliko informacije in jih preko WiFi povezave pošlje strežniku. Strežnik je najpomembnejši del IoT sistema in glavni del naprave, kjer poteka večina računalniške obdelave. Komunicira s kontrolerjem in mu pošilja ukaze, kot je na primer vklop škropilnika s PANTIDE, ima pa tudi SQLite podatkovno bazo, ki shranjuje informacije in rezultate obdelave.

=== UPORABNIK ===
Stranka na mobilni aplikaciji MediaTek Cloud Sandbox dobi podatke o stanju na kmetijski površini v realnem času. Če ima dostop do interneta, lahko kadarkoli in kjerkoli vklopi škropilnike, ne da bi za to morala iti do kmetijske površine. Dodatno pa IoT sistem sčasoma sestavi podatkovno bazo iz zbranih podatkov, in ko je ta dovolj obsežna, se z uporabo metod modeliranja lahko predvidi pogoje v prihodnosti, kot je na primer število škodljivcev, in na ta način vzpostavi samodejni nadzor razpršilnega sistema PANTIDE ali vode, ki je natančnejši in učinkovitejši.

== LABORATORIJSKI EKSPERIMENTI ==
Zaporedja izbranih treh toksinov je enostavno izražati v ''E. coli'' seva BL21 Rosetta Gami, zato so pripravili biokocke za delo s tem sevom. Pri vseh so uporabili močan T7 promotor, ki je kompatibilen z izbrano bakterijo, poleg tega pa je dober za izražanje proteinov, ki vsebujejo številne disulfidne vezi. Sledilo je zaporedje RBS, zaporedje izbranega toksina in trialaninski linker. Pri vseh biokockah so za linker za zaporedjem toksina dodali tudi histidinsko oznako za čiščenje proteinov in terminator. Tako so pripravili biokocke Bba_K1974011, Bba_K1974012 in Bba_K1974013. Pripravili pa so še biokocke Bba_K1974021, Bba_K1974022 in Bba_K1974023, pri katerih so med linkerja toksina in histidinske oznake vstavili še zaporedje za lektin. Pripravili so tudi biokocko Bba_K1974033 pri kateri so linker med zaporedjem toksina in lektinom zamenjali z GS linkerjem, ki naj bi zagotovil pravilnejše zvijanje proteina.

Konstrukte so pomnožili s PCR in preverili njihovo dolžino z gelsko elekroforezo. Nato so jih izrazili v ''E. coli'' BL21 Rosetta Gami in po sonifikaciji celic izvedli SDS-PAGE, da so potrdili ustrezno izražanje. Sledilo je čiščenje proteinov, ki so jih nato uporabili za nadaljnje eksperimente z insekti. 

Eksperimente z žuželkami so razdelili v tri sklope: tridelni začetni test hranjenja žuželk, testiranja za izboljšave fuzijskih proteinov in test preference. Za testno žuželko so izbrali gosenice vešče ''Spodoptera litura'', ker so te glavni škodljivec ter izbrani toksini delujejo na red metuljev.

V začetnih poskusih hranjenja so primerjali PANTIDE toksine in toksine povezane z lektinom tako, da so pripravili tri razredčitve bioinsekticida (1/125x, 1/25x in 1/5x) in redčitev nanesli na liste rastlin. Za pozitivno kontrolo so uporabili Bt toksin, za negativno pa dd vodo. V petrijevko so nato k rozetam listov dodali po pet gosenic, da so ponazorili hude razmere škodljivcev, in opazovali površino objedenih rozet listov ter odziv gosenic po 12 urah glede na koncentracijo nanešenega bioinsekticida. Ta test so ponovili trikrat. Hipoteza je bila, da bo zaradi nevrotoksičnosti PANTIDE gosenice paraliziral in bodo te posledično poginile. V skladu s pričakovanji je bila površina preostale rozete lista najmanjša pri največji redčitvi PANTIDE, pri tem pa so bili toksini z lektinom učinkovitejši kot sami toksini. V nasprotju z zastavljeno hipotezo, pa PANTIDE ni deloval kot insekticid, temveč je izkazal repelentno delovanje.

V testu izboljšave fuzijskega proteina so primerjali delovanje konstruktov Hv1a, Hv1a-lektin in Hv1a-lektin-GS linker pri 10, 2 in 0,4 µM koncentracijah. Ponovno so dokazali, da z višjo koncentracijo preostane večja površina rozete, hkrati pa ugotovili, da med uporabljenimi konstrukti najbolje deluje toksin z GS linkerjem.

Pri testu preference pa so v petrijevko k rozeti negativne kontrole in rozeti obdelano s PANTIDE dodali pet gosenic in sistem opazovali dve uri. Gosenice so večinsko objedle negativno kontrolo, s čimer so dokazali repelentno delovanje PANTIDE.

== ZAKLJUČEK ==
Kljub temu, da PANTIDE sicer ni deloval kot insekticid, temveč je deloval kot repelent, je rezultat vseeno v skladu z njihovim zastavljenim ciljem, da bi z uporabo njihovega bioinsekticida zmanjšali škodljive vplive na okolje, hkrati pa učikovito zatirali škodljivce. Mehanizem delovanja repelacije zaenkrat še ni poznan. Z elongacijo linkerja ima fuzijski protein navečjo repelentnost, po učinkovitosti pa je primerljiv z Bt toksinom. 
To poletje so uspeli izvesti predhodne laboratorijske ocene delovanja in razvili začetno stopnjo zbiranja sredstev za masovno proizvodnjo. Za obsežno komercializacijo produkta, pa bodo produkt morali testirati še na realnih kmetijskih površinah, da bodo ugotovili:
*maksimalno letalno koncentracijo PANTIDE
*najboljše pogoje za zatiranje škodljivcev
*kako učinkovito in v velikih količinah proizvajati PANTIDE, katerega serije bodo standardizirane
*ali bi z natančnejšim pregledom podatkovnih baz lahko v napravi uporabili tudi druge toksine
*ali bi se z isto idejo delovanja detektor lahko uporabljal tudi za nadzor populacije komarjev in na ta način uporabil kot indikator za začetek izvajanja previdnostnih ukrepov zoper dengo
Za prihodnjo komercializacijo so se že posvetovali s patentnim inženirjem, da so prijavili patent za PANTIDE, ki vključuje DNA zaporedje, načrtovanje DNA in protokole za pripravo učinkovitih PANTIDE produktov.

== VIRI ==
*iGEM 2016: NCTU_Formosa, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:NCTU_Formosa 
*[1] - Monique J. Windley, Volker Herzig, Slawomir A. Dziemborowicz, Margaret C. Hardy, Glenn F. King and Graham M. Nicholson, “Spider-Venom Peptide as Bioinsecticide,” Toxins Review, 2012, 4, pp. 191-227.
*[2] - Wang, X.H.; Connor, M.; Wilson, D.C.; Wilson, H.I.; Nicholson, G.M.; Smith, R.; Shaw, D.; Mackay, J.P.; Alewood, P.F.; Christie, M.J.; King, G.F. “Discovery and structure of a potent and highly specific blocker of insect calcium channels,” J. Biol. Chem. 2001, 276, 40306–40312
*[3] - Elaine Fitches, Martin G. Edwards, Christopher Mee, Eugene Grishin, Angharad M. R. Gatehouse, John P. Edwards, John A. Gatehouse “Fusion proteins containing insect-specific toxins as pest control agents: snowdrop lectin delivers fused insecticidal spider venom toxin to insect haemolymph following oral ingestion,” Journal of Insect Physiology, 2004,50, pp.61-71
*[4] - Elaine Fitches, Martin G. Edwards, Christopher Mee, Eugene Grishin, Angharad M. R. Gatehouse, John P. Edwards, John A. Gatehouse “Fusion proteins containing insect-specific toxins as pest control agents: snowdrop lectin delivers fused insecticidal spider venom toxin to insect haemolymph following oral ingestion,” Journal of Insect Physiology, 2004, 50, pp.61-71
*[5] - Volker Herzig and Glenn F. King “The Cysteine Knot Is Responsible for the Exceptional Stability of the Insecticidal Spider Toxin Omega-Hexatoxin Hv1a,” Toxin Review, 20157. pp. 4366-4380
*[6] - Elaine C. Fitches, Prashant Pyati, Glenn F. King, John A. Gatehouse, “ Fusion to Snowdrop Lectin Magnifies the Oral Activity of Insecticidal Omega-Hexatoxin-Hv1a Peptide by Enabling Its Delivery to the Central Nervous System,”

[[Seminarji SB 2016/17]]