Povečana razgradnja biomase in večji izkoristek etanola z izražanjem gensko spremenjene monolignol 4-O-metiltransferaze v lesu rastlin rodu Populus
From Wiki FKKT
Enhancing digestibility and ethanol yield of Populus wood via expression of an engineered monolignol 4-O-methyltransferase
Les je eden izmed najpomembnejših organskih materialov na svetu. Poleg tega, da je bil v zgodovini vodilni vir pridobivanja energije, se na široko uporablja tudi npr. kot gradbeni material ali pri proizvodnji papirja in izdelavi pohištva. V zadnjem času pa dobiva vse večji pomen kot vir enostavnih sladkorjev, ki služijo za pridobivanje biogoriv in nekaterih industrijsko pomembnih bioloških produktov.
Contents |
Zgradba in lastnosti lesa
Les je sekundarni ksilem, ki je zgrajen iz osrednje lamele in iz več plasti sekundarne celične stene, sestavljenih iz celuloze (40-50 %) ter hemiceluloze (25-30 %). Olesenele rastline prepoznamo predvsem po nalaganju lignina v celični steni. Molekule lignina tvorijo mrežasto strukturo in delujejo kot vezivo, ki varuje celulozo in hemicelulozo pred razgradnjo. Rastlini daje dodatno trdnost in ji omogoči stabilnost ter rast v višino. Naloga lignina je prav tako ustvariti hidrofobno bariero, s čimer prepreči dostop encimom, da razgradijo polisaharide do enostavnejših sladkorjev.
Sinteza lignina
Lignini so kompleksne in heterogene polimerne makromolekule zgrajene iz 4-hidroksifenilpropanoidnih enot. Gradniki teh enot so monolignoli, in sicer p-kumaril, koniferil in sinapil alkoholi. Sinteza lignina poteče po šikimatni poti iz glukoze s pomočjo različnih encimov. Glavni encim, ki sodeluje pri sintezi ligninskih prekurzorjev je fenilalanin amonijak liaza (PAL). Sama sinteza vključuje nastanek radikalskih intermediatov iz prekurzorjev, ki reagirajo med seboj ali z že nastajajočim polimerom. Zaradi neusmerjene reakcije radikalov je struktura lignina razvejana.
Rezultati
Glavni problem pri pretvorbi rastlinske biomase do enostavnih sladkorjev je lignin. Znanstveniki so želeli pripraviti rastline z manjšo količino lignina v celični steni, ne da bi pri tem vplivali na rast rastline. Ugotovili so, da metilacija 4-hidroksi skupine na monolignolu prepreči njegov nastanek. Z naključno mutagenezo, t.i. iterativno saturacijsko mutagenezo (ang. iterative saturation mutagenesis), so pripravili variante encima O-metiltransferaze, ki katalizira 4-O-metilacijo monolignolov (MOMTji). Za katalitično najučinkovitejšo se je izkazala varianta MOMT4. Ekspresijsko kaseto gena MOMT4 so z Agrobacterium vnesli v histro rastočo hibridno trepetliko (Populus tremula x Populus alba) pod kontrolo promotorja gena za fenilalanin amonijak liazo-2 (PAL2) iz graha. Po dveh mesecih so v listih transgenih rastlin na podlagi retencijskih časov in UV spektrov zaznali dva metabolita, 4-O-metiliran koniferil alkohol in 4-O-metiliran sinapil alkohol. Prisotnost teh dveh metabolitov dokazuje pravilno delovanje mutiranega encima MOMT4, katerega naloga je modifikacija monolignolov v ustrezne 4-O-metilirane komponente.
Drevesa, ki so proizvajala mutiran encim, so imela manjšo količino lignina v celični steni. Dodatne analize z 2D NMR eksperimenti so pokazale povečano tvorbo prečnih povezav med polimeri, kar je privedlo do kondenzacije lignina. Po encimski razgradnji lesa s tako spremenjeno strukturo lignina se je količina sproščenih enostavnih sladkorjev povečala za 62 %. Pri rastlinah z mutiranim MOMT4 so med drugim opazili tudi polovično zmanjšanje količin fenolnih spojin, kot so hidroksicinamati in hidroksibenzoati. Ti se vežejo s polisaharidi in ligninom preko estrskih vezi in lahko igrajo vlogo pri spreminjanju okidacijskega potenciala monolignolov. V celici se najprej povežejo s sinapil alkoholom, nato pa se vgradijo v ligninski polimer.
Pri slikanju vzorcev lesa z IR so ugotovili, da povečano izražanje MOMT4 vpliva na akumulacijo in ultrastrukturo celuloznih vlaken. Istočasno s spremembami sestave lignina in strukture MOMT4 so namreč opazili kar 51 % višjo vsebnost celotne celuloze in 15 % kristalinične celuloze, vendar na odlaganje hemiceluloze to ni imelo vpliva.
Pomembno je, da kljub spremembam v sestavi in strukturi lignina ter celuloze pa ni prišlo do sprememb v razvoju in rasti oz. v procesu nastajanja rastlinske biomase.
Zaključek
Proizvodnja biogoriv in drugih biološko pomembnih produktov zahteva sproščanje enostavnih sladkorjev iz lesne biomase. Glavni korak k izboljšanju razgradljivosti celične stene in večjih izkoristkov biogoriv (predvsem etanola) je zmanjšanje količine lignina in/ali spreminjanje njegove strukture s pomočjo spreminjanja genov, vključenih v biosintezno pot monolignolov. Večina postopkov, s katerimi se odstranjuje lignin je neučinkovitih in dragih. Z izražanjem MOMT4 v hibridni trepetliki pa so znanstveniki dosegli do 62 % večje izločanje enostavnih sladkorjev in več kot 40 % večji izkoristek etanola, brez vpliva na rast in razvoj transgenih rastlin.
Vir
Pojdi nazaj na MBT seminarji 2017.
