Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)

From Wiki FKKT

Revision as of 16:15, 26 March 2017 by Domen.klofutar (Talk | contribs)
(diff) ←Older revision | Current revision (diff) | Newer revision→ (diff)
Jump to: navigation, search

Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy Lactococcus lactis NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis

Vnetje sluznice prebavnega trakta je največkrat posledica obsevanj in agresivne kemoterapije, ki jo uporabljamo za zdravljenje raka dojk, črevesja, trebušne slinavke ter različnih oblik raka zgornjih prebavil. Pri več kot 80 % pacientov se pojavi zaradi zdravljenja s 5-fluorouracilom (5-FU). 5-FU je nespecifičen citostatik, ki kot inhibitor timidilat sintaze deluje predvsem na hitro deleče celice, med katere spadajo tudi enterociti vzdolž prebavnega traku. Vnetje je posledica morfoloških sprememb sluznice.

Do danes še ni učinkovitega zdravila, ki bi odpravil neželene učinke omenjenega kemoterapevtika. V preteklih študijah so dokazali, da nekatere mlečnokislinske bakterije predstavljajo potencial pri lajšanju simptomov vnetja prebavil. Pred kratkim so odkrili, da bakterija Lactococcus lactis proizvaja protimikrobne peptide, ki na mišjih modelih delujejo kot zdravilo proti kolitisu. Zato so znanstveniki poskušali razviti rekombinantni sev L. lactis, ki bi izražal človeški protein Reg3A. Reg3A poznamo kot s pankreatitisom povezani protein I (PAP). Spada v družino proteinov, ki sodelujejo pri regulaciji proliferacije epitelijskih celic. V tankem črevesu ga proizvajajo Panethove celice. Pripravili so kontrolni sev NZ9000, ki je vseboval vektor pSEC in NZ9000, ki je vseboval vektor pSEC z vstavljenim zapisom za PAP.


Contents

Vpliv supernatanta L. lactis na patogene bakterije

L. lactis brez vstavljenega zapisa za PAP in L. lactis z vstavljenim zapisom za PAP so gojili v gojišču BHI v prisotnosti selekcijskega markerja. Vse bakterije so vsebovale vektor. Po določenem času so izvedli indukcijo z nizinom in celice kasneje centrifugirali ter prefiltrirali supernatante. Supernatante so nato inokulirali z dvema patogenima bakterijama, ki sta lahko prisotni v hrani: L. monocytogenes in E. faecalis. Njuno rast so opazovali po 2 in 4 urah in jo podali v številu CFU. Ugotovili so, da izražanje PAP ne vpliva na inhibicijo rasti L. monocytogenes. Inhibicija rasti se je pojavila po 4 urah. S tem so potrdili, da L. lactis in vitro deluje kot inhibitor patogenih bakterij. Po 2 urah se je število CFU E. faecalis v prisotnosti naravnih in gensko spremenjenih bakterij zmanjšalo za dvakrat, po 4 urah pa je prevladala inhibicija rasti zaradi L. lactis, ki je izražal PAP. Iz tega lahko sklepamo, da je izražanje PAP ključno za in vitro inhibicijo rasti E. faecalis.


Vpliv L. lactis in izražanja PAP na arhitekturo in morfologijo panethovih celic ileuma

Vse histološke poskuse so opravljali na miših BALB/c, ki so jih glede na dieto razdelili v osem skupin. Prvim štirim skupinam so po desetih dneh interperitonealno brizgali fiziološko raztopino (kontrola), drugim štirim skupinam pa 5-FU. Opazovali so izgubo mase kot posledico vnetja prebavil zaradi 5-FU. Ugotovili so, da prisotnost L. lactis ali PAP nima vpliva na izgubo mase. Po evtanaziji miši so pripravili histološke rezine ileuma. Opazili so, da so pri miših, ki so bile izpostavljene 5-FU, na sluznici črevesa prisotne lezije. Če so bile prisotne tudi bakterije L. lactis, do vnetja ni prišlo. Izkazalo se je, da PAP ne vpliva na prisotnost lezij v črevesu po zdravljenju s 5-FU. Nasprotno je arhitektura črevesnega epitelija po izpostavljenosti kemoterapevtiku odvisna od omenjenega proteina. V skupinah miši, kjer ni bil prisoten, so bili vili krajši, razmerje med črevesnimi kriptami in velikostjo vilov se je zmanjšalo, prav tako pa se je zmanjšala tudi gostota granul Panethovih celic.


Prisotnost molekul imunskega sistema v ileumu

Raziskovalci so z encimskimi testi ugotavljali aktivnost dveh encimov v homogenizatu črevesa miši, ki so jim dodali 5-FU. Mieloperoksidaza in peroksidaza eozinofilcev sta encima, ki označujeta prisotnost nevtrofilcev in eozinofilcev. Ugotovili so, da preiskovana bakterija zmanjša prisotnost omenjenih celic, PAP pa na njihovo število nima dodatnega vpliva. Enake rezultate so dobili tudi po izvedbi testa ELISA za protitelesa IgA.


Zaključki

Znanstveniki so pokazali, da rekombinantna oblika človeškega PAP, ki ga izražajo bakterije L. lactis, uspešno inhibira rast nekaterih patogenih sevov in ohranja arhitekturo črevesne sluznice tudi ob uporabi 5-FU kot kemoterapevtika. Omenjen gensko spremenjen organizem predstavlja potencialno zdravilo za lajšanje neželjenih učinkov agresivne kemoterapije. Kljub obetom bi po mojem mnenju bil nujen še sistem za preprečevanje širjenja L. lactis v naravo.


MBT seminarji 2017

Personal tools