View source for Pri nizkih temperaturah aktivna pululanaza tipa I iz metagenoma vročih vrelcev omogoča učinkovito klestenje in proizvodnjo odpornega škroba

===Uvod===
'''Škrob''' spada med rezervne rastlinske polisaharide in je sestavljen iz amiloze (15–30 %) ter amilopektina (70–85 %) [1-3]. Delček škroba, ki se v tankem črevesu ob delovanju prebavnih encimov ne razgradi in se ne absorbira, imenujemo odporni škrob (ang. resistant starch ali RS). RS delimo na osnovi oblike, izvora in lastnosti v pet skupin. Z retrogradacijo naravnega škroba lahko pridobimo RS3, ki ima negranularno strukturo in povečano kristaliničnost. Je tudi termično stabilen, poleg tega pa ima visoko hranilno vrednost in lastnosti prehranskih vlaknin, zato postaja vedno bolj uporaben v prehrambni industriji [1, 4]. 

'''Pululanaza''' je klestilni encim, ki ga, glede na katalitično specifičnost, delimo v dva tipa. Pululanaza tipa I lahko hidrolizira α-1,6-glikozidne vezi, kar ji omogoča pretvorbo amilopektina v škrobu v linearne polimere glukoze. To predstavlja prednost pri proizvodnji RS3, saj se hidrolizirani polimeri lažje in hitreje agregirajo oziroma kristalizirajo v odpornejšo obliko [1].

===Odkritje gena in postopek priprave rekombinantnega encima===

Znanstveniki so v metagenomu indijskega termalnega vrelca odkrili gen ''pul<sub>M</sub>'', ki zapisuje pululanazo tipa I, in ga prenesli v vektor pET28a(+). Kompetentne ''E. coli'' BL21[DE3] so v nadaljevanju transformirali s tako pripravljenim plazmidom in z dodatkom IPTG inducirali izražanje encima. Pululanazo so iz celičnega lizata izolirali z Ni-afinitetno kromatografijo, očiščeno frakcijo pa analizirali s PAGE in tako določili čistost (95 %) ter molsko maso encima (približno 80 kDa) [1].

===Analiza kinetičnih lastnosti encima===

Hidrolitično aktivnost pululanaze Pul<sub>M</sub> pri razgradnji substrata pululana so izmerili tako, da so s pomočjo reagenta DNS (dinitrosalicilna kislina) spremljali delež reducirajočih koncev v raztopini. Pululan je linearni polisaharid, zgrajen iz maltotrioznih podenot, povezanih z α-1,6-glikozidnimi vezmi, ki jih med inkubacijo Pul<sub>M</sub> cepi [1,5]. 

V nadaljnjih poskusih so preverjali encimsko aktivnost in stabilnost pululanaze pri različnih temperaturah (4–80 °C) ter vrednostih pH (4,5–10), poleg tega so določali tudi vpliv kovinskih ionov in drugih kemikalij (detergentov in denaturantov) na katalitične lastnosti. Maksimalna katalitična aktivnost je bila opažena pri 40 °C in pH med 6 in 7. Encim je v alkalnem manj stabilen in ima manjšo katalitično aktivnost, pri nizkih vrednostih pH pa pululanaza popolnoma izgubi katalitično aktivnost. Pri 4 °C lahko Pul<sub>M</sub> razgrajuje substrat s 50 % učinkovitostjo. Poskusi so pokazali tudi izjemno stabilnost encima pri optimalni temperaturi, saj se je aktivnost po štiridesetih dneh na 40 °C zmanjšala za samo 15 %. Ključno vlogo pri ohranjanju encimske aktivnosti ima Ca<sup>2+</sup>, ki stabilizira tridimenzionalno proteinsko strukturo. Dodatek detergentov in denaturantov ni ključno vplival na encimsko aktivnost, se je pa aktivnost povišala ob dodatku reducentov [1].

===Priprava in analiza odpornega škroba===

V prvem koraku so po predhodno znanem postopku iz krompirja, ki vsebuje 13–23 % škroba, ekstrahirali belo oborino škrobnih granul. Nato so iz pridobljenega produkta s pomočjo pululanaze Pul<sub>M</sub> s 45 % izkoristkom pripravili odporni škrob tipa 3 in ga v nadaljevanju še ovrednotili.

Najprej so z vrstičnim elektronskim mikroskopom (SEM) analizirali vzorec ekstrahiranega krompirjevega škroba, vzorec s pululanazo cepljenega škroba in odporni škrob. Ekstrahiran krompirjev škrob je vključeval gladke, ovalne ali okrogle granule velikosti 10–70 μm, kar se je ujemalo s podatki iz literature. Po hidrolizi s pululanazo je postal nativni škrob nepravilne, spužvaste oblike, kar je posledica agregacije okleščenih linearnih glukoznih polisaharidov. S SEM so opazili tudi, da je retrogradacija tako hidroliziranega škroba omogočila nastanek mase prepletenih vlaken s čvrsto strukturo, ki jih po retrogradaciji s pululanazo neobdelanega škroba ne opazimo. Termična stabilnost odpornega škroba je bila v primerjavi z nativnim škrobom višja, kar je posledica bolj kompaktne in trde strukture agregiranih polisaharidnih verig. 

Nativnemu in odpornemu škrobu so v nadaljevanju določili tudi rentgenski difrakcijski vzorec. Rezultati so pokazali, da ima pridobljen odporni škrob višjo stopnjo kristaliničnosti od nativnega.
 
Za konec so določili tudi sposobnost encimske razgradnje nativnega škroba in RS3 ''in vitro'' ob dodatku α-amilaze. Pridobljen odporni škrob je bil za razliko od nativnega odporen na encimsko razgradnjo [1].

===Zaključek===

V študiji so opisali na novo odkrito, pri nizkih temperaturah aktivno pululanazo tipa I Pul<sub>M</sub>, ki je sposobna učinkovite razgradnje α-1,6-glikozidne vezi krompirjevega škroba, pri čimer se poveča delež amiloze. S procesom retrogradacije encimsko obdelanega škroba jim je uspelo pridobiti odporni škrob tipa 3, ki ima v primerjavi z nativnim škrobom povišano kristaliničnost, je termično stabilen in odporen na encimsko razgradnjo. Z raziskavo so tako pokazali, da bi lahko pululanazo Pul<sub>M</sub> uporabljali v industriji za proizvodnjo odpornega škroba [1].

===Viri in literatura===
# M. Thakur, N. Sharma, A. K. Rai, and S. P. Singh: A novel cold-active type I pullulanase from a hot-spring metagenome for effective debranching and production of resistant starch. ''Bioresour. Technol.'', '''2021''', ''320'', 124288.
# E. Bertoft: Understanding starch structure: Recent progress. ''Agronomy'', '''2017''', ''7''.
# H. Omoregie Egharevba: Chemical Properties of Starch and Its Application in the Food Industry. ''Chemical Properties of Starch'', '''2020'''.
# D. Yi, W. Maike, S. Yi, S. Xiaoli, W. Dianxing, and S. Wenjian: Physiochemical Properties of Resistant Starch and Its Enhancement Approaches in Rice. ''Rice Science'', '''2021''', ''28'', 31–42.
# O. Pınar, F. Yangılar, P. Oğuzhan, and F. Yangılar: Pullulan: Production and usage in food ındustry. ''African J. Food Sci. Technol.'', '''2013''', ''4'', 57–63.