View source for Priprava in ovrednotenje novega seva bakterij Lactococcus lactis za proizvodnjo protimikrobnega peptida

==Problem==
Patogeni, ki jih lahko najdemo v hrani, predstavljajo velik problem človeškemu zdravju, saj povzročajo številne bolezni. Problematične so predvsem bakterije, ki lahko tvorijo biofilme, saj jih ti zavarujejo pred antibiotiki, posledično pa je take bakterije težje eliminirati iz živilskih obratov [1,2]. Raziskovalci zato iščejo nove načine, kako se boriti proti patogenom v hrani in zagotoviti varno pridelavo hrane. 

==Protimikrobni peptidi==
Protimikrobne peptide najdemo v vseh živih organizmih. Pri višjih organizmih so del prirojenega imunskega sistema in učinkujejo proti različnim mikroorganizmom. Povprečno jih sestavlja od 10 do 50 aminokislin in so pozitivno nabiti. So naravna alternativa kemičnim konzervansom, dobro pa delujejo tudi proti patogenim bakterijam, ki tvorijo biofilme [3]. V dotični raziskavi so uporabili fuzijo 2 protimikrobnih peptidov, ki izvirata iz kameljega laktoferina (protein, ki ima že sam po sebi protimikrobno delovanje). Ta peptida sta laktoferampin in laktofericin, fuzijo pa so poimenovali cLFchimera [4].

==''Lactococcus lactis''==
''L. lactis'' je gram pozitivna bakterija, ki se zaradi številnih ugodnih lastnosti že stoletja uporablja za fermentacijo mlečnih izdelkov in kot konzervans. Ni sposobna kolonizacije črevesja, ne proizvaja endotoksinov, je splošno prepoznana kot varna in ima številne probiotične lastnosti. Uporablja se tudi v biotehnologiji, predvsem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov [5]. Zaradi omenjenih lastnosti in potencialne uporabe v prehranski industriji so si jo raziskovalci izbrali kot sistem za izražanje cLFchimere [4].

==Potek eksperimenta==
Izražanje rekombinantnega peptida so izvedli v ''L. lactis'' AMJ1453. Posebnost tega seva je, da je avksotrofen za D-alanin (ključna komponenta celične stene), zato lahko izvajamo selekcijo na osnovi alanin racemaze, ki pretvarja L-alanin v D-alanin. Uporabili so ekspresijski vektor pAMJ1653, ki je namenjen izražanju v ''L. lactis''. Preko restrikcijskih mest ''Sap''I in ''Sal''I so pod promotor P170 vstavili sintezni gen za cLFchimero s C-končno heksahistidinsko oznako. Zapis za signalni peptid na vektorju omogoča izločanje cLFchimere v gojišče [4].

Bakterije so transformirali z elektroporacijo in jih gojili v gojišču M17 brez D-alanina. S PCR na osnovi kolonije so preverili prisotnost vključka v vektorju. Izražanje gena za cLFchimero so preverili tudi tako, da so supernatant iz gojišča očistili z nikelj-afinitetno kromatografijo in ga analizirali z NaDS-PAGE [4].

Protimikrobno aktivnost supernatanta so preverili z metodo difuzije z diski in merjenjem premerov con inhibicij. Minimalno inhibitorno koncentracijo cLFchimere so določili z metodo razredčevanja v mikrotitrski plošči. Inhibitorni učinek cLFchimere na tvorbo biofilmov so preverjali tako, da so bakterije gojili ob prisotnosti cLFchimere, dodali kristal vijolično in izmerili absorbanco pri 590 nm. Sledile so še analiza termične stabilnosti cLFchimere, analiza antioksidativne sposobnosti in računalniška analiza interakcij cLFchimere z DNA oz. LPS [4].

==Rezultati==
Analiza supernatanta z NaDS-PAGE je pokazala, da so transformirane bakterije proizvajale rekombinanten peptid in ga izločale v gojišče. Po čiščenju so pridobili 0,13 mg cLFchimere na mL gojišča [4].

Pri metodi difuzije z diski je supernatant s cLFchimero deloval protibakterijsko proti vsem uporabljenim patogenim bakterijam (''E. coli, S. aureus, S. typhimurium, E. faecalis, L. monocytogenes'' in ''P. aeroginosa''). V vseh primerih je večji volumen supernatanta na disku povzročil večjo cono inhibicije. V primeru ''E. coli'' in ''S. aureus'' je disk z 40 µL supernatanta povzročil večjo cono inhibicije kot disk z 10 mg gentamicina. Prav tako je cLFchimera inhibirala tvorbo biofilma pri vseh analiziranih patogenih bakterijah (''P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis'' in ''E. coli''). 40 minutno gretje pri 100 °C ni imelo znatnega vpliva na protibakterijsko sposobnost cLFchimere proti  ''S. aureus'' kot modelni grampozitivni bakteriji [4].

Z analizo antioksidativne sposobnosti so ugotovili, da cLFchimera deluje tudi kot antioksidant, saj reagira s prostimi radikali (v raziskavi so uporabili DPPH). Koncentracija 300 µg/mL je inaktivirala približno polovico DPPH. Z uporabo še višje koncentracije cLFchimere je antioksidativna aktivnost upadla [4]. 

Računalniške simulacije molekulske dinamike so pokazale, da cLFchimera ob vezavi na DNA oz. LPS spremeni strukturo. Ugotovili so, da je v LPS glavna tarča peptida lipid A. V povprečju je cLFchimera z LPS tvorila 5 vodikovih vezi, z DNA pa 4. K ugodni prosti energiji vezanja so največ prispevale pozitivno nabite aminokisline in celokupno gledano je prosta energija vezanja na DNA bila nekoliko nižja kot na LPS [4]. 

==Zaključek==
Fuzijski peptid cLFchimera učinkuje proti različnim patogenim bakterijam, inhibira tvorbo biofilmov in ima antioksidativne lastnosti. ''In silico'' izkazuje visoko afiniteto do DNA in LPS kot glavni bakterijski tarči. Z vnosom gena za cLFchimero v L. lactis je raziskovalcem uspelo pripraviti sev, ki ima potencial za uporabo v prehranski industriji [4].

==Literatura==
[1] T. Bintsis: Foodborne pathogens. ''AIMS Microbiol.'' '''2017''', ''3(3)'', str. 529–563.

[2] M. Schirone, P. Visciano, R. Tofalo, G. Suzzi: Editorial: Foodborne Pathogens: Hygiene and Safety. ''Front. Microbiol.'' '''2019''', ''10''.

[3] M. Mahlapuu, J. Håkansson, L. Ringstad, C. Björn: Antimicrobial Peptides: An Emerging Category of Therapeutic Agents. ''Front. Cell. Infect. Microbiol.'' '''2016''', ''6''. 

[4] A. Tanhaeian, M. Mirzaii, Z. Pirkhezranian, M. H. Sekhavati: Generation of an engineered food-grade Lactococcus lactis strain for production of an antimicrobial peptide: in vitro and in silico evaluation. ''BMC Biotechnol.'' '''2020''', ''20(1)'', str. 19.

[5] A. A.-L. Song, L. L. A. In, S. H. E. Lim, R. A. Rahim: A review on Lactococcus lactis: from food to factory. ''Microb. Cell Fact.'' '''2017''','' 16(1)'', str. 55.