View source for Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARSCoV2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov

''Povzeto po članku: [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9967482/. Gurjar, P., Karuvantevida, N., Rzhepakovsky, I. V., Khan, A. A., & Khandia, R. (2023). A synthetic biology approach for vaccine candidate design against delta strain of sars-cov-2 revealed disruption of favored codon pair as a better strategy over using rare codons. Vaccines, 11(2), 487. ]''


== UVOD ==

Delta različica SARS-CoV-2 (B.1.617.2) ima 23 mutacij v primerjavi s prvim identificiranim sevom COVID-19 (sev alfa) [10]. Dvanajst od teh mutacij je v proteinu bodice spike, ki omogoča pritrditev gostiteljskih celic in je vključen v virusno patogenezo. Različica B.1.617.2 (delta) je bila prvič odkrita v Indiji decembra 2020 in je hitro postala najpogosteje prijavljena različica po vsem svetu [1]. Ta različica je bila povezana z globalnim porastom primerov, večjim virusnim bremenom, daljšim trajanjem nalezljivosti in visokimi stopnjami ponovne okužbe. 
Tradicionalno se oslabljeni kandidati za cepivo ustvarijo s pripravo serijskih pasaž v neoptimalnih pogojih, kar sčasoma povzroči atenuacijo virusa. Glavna težava je tveganje izgube atenuacije, zaradi česar lahko cepivo postane neučinkovito. 
Namen te študije je bil raziskati molekularne značilnosti strukturnih genov ( (protein bodice (S), jedrni protein (N), membrana (M) in ovojnica (E))) delta različice COVID-19, da bi identificirali potencialne tarče za razvoj kandidata za cepivo z uporabo sintezne biologije. Analizirali so različne vidike, kot so sestava, uporaba sinonimnih kodonov in razmerje med gostiteljevo tRNA in prednostnimi kodoni iz teh genov. Sinonimni kodoni se nanašajo na dva ali več kodonov, ki kodirajo isto aminokislino. Pristranskost kodona (angl. codon bias), biološki pojav, ki opisuje neenakomerno uporabo sinonimnih kodonov, se lahko uporablja za optimizacijo kodona (CO) in deoptimizacijo kodona (CD) [2].

== MATERIALI IN METODE ==

Pridobili so zaporedja iz Nacionalnega centra za biotehnološke informacije (NCBI) za delta sev SARS-CoV-2. <br />
DNASTAR Lasergene Inc. je bil uporabljen za izračun dinukleotidnega razmerja obetov za gene E(ovojnica), M(membrana), NP(jedrni protein) in S (protein bodice).<br />
RSCU pomeni relativno sinonimno uporabo kodona in je merilo, ki pomaga identificirati prednostne in neprednostne kodone za določeno aminokislino.<br />
Analiza konteksta kodona (učinke sosednjih zaporedij na prevajanje proteinih) in določitev najpogostejših parov kodonov sta bila opravljena s programsko opremo Anaconda 2®.<br />
Strežnik RNAfold je bil uporabljen za izračun minimalne proste energije (MFE) transkripta. Vrednosti CAI Codon Adaptation Index) so bile izračunane z uporabo strežnika CAICal.<br />

== REZULTATI ==
=== Značilnosti sestave strukturnih genov seva delta SARS-CoV-2 ===
Ta študija je preučevala nukleotidno sestavo strukturnih genov ((bodice(S), nukleoprotein (NP), membrana (M) in ovojnica (E))) delta različice virusa SARS-CoV-2. Velikosti genov E, M, N in S so 228 bp, 669 bp, 1260 bp in 3822 bp [3]. Rezultati so pokazali, da so imeli ti geni visoko vsebnost AT in večjo številčnost nukleotidov T, razen gena NP. Poleg tega so imeli vsi geni visok delež nukleotidov T na tretjem položaju kodona [2].

=== Analiza razmerja obetov dinukleotidov ===
Iz analize je razvidno, da sta TpT in CpA pokazala najvišjo stopnjo variacije vrednosti. Povprečna vrednost dinukleotida TpT je bila med 0,867–2,383, CpA pa med 0,359–1,569 za štiri strukturne gene virusa delta. Dinukleotid TpT je bil premalo zastopan v genu NP, medtem ko je v drugih genih preveč zastopan. CpG je bil, kot je bilo pričakovano, premalo zastopan v vseh genih. Gostiteljske celice zaznavajo CpG dinukleotid kot molekularne vzorce, povezane s patogenom in zato virusni patogeni ponavadi zmanjšajo pogostost vsebnosti CpG v svojem genetskem materialu [4]. Na podlagi povprečnega razmerja obetov je bilo očitno, da so dinukleotidi GpA, GpG, CpC in CpG premalo zastopani (razmerje obetov < 0,78), medtem ko so bili TpT, ApA, CpT in TpG preveč zastopani (razmerje obetov > 1,23). Vrednosti razmerja obetov za gene E, M in NP so dokaj primerljive, čeprav obstaja majhna razlika za gen NP [2].
=== Dinukleotidna pristranost (angl. Dinucleotide Bias) na stičišču kodonov ===
Študija je ocenila pristranost dinukleotidov na stičišču p3-1 za CpG in TpA v štirih genih delta seva. Najdeni so bili tako pozitivni kot negativni konteksti, pri čemer so bili negativni konteksti bolj izraziti za CpG v genih S in N. V stičišču TpA so bili negativni konteksti močno prisotni v genu S, medtem ko so bili pozitivni konteksti najdeni le v genu E. Opravljena analiza je pokazala, da so na stičišču prisotne vse vrste kontekstov (brez konteksta, pozitivni kontekst, negativen kontekst). Vendar je bilo ugotovljeno, da so negativni konteksti pogostejši za stičišče TpA v genu S, na kar so morda vplivali selektivni pritiski [2]. 
=== RSCU vrednosti kodonov iz štirih strukturnih genov ===
Višje vrednosti RSCU kažejo na prednostni kodon, nižje vrednosti pa kažejo na uporabo neprednostnih kodonov. Analiza je pokazala, da je vzorec uporabe kodona edinstven za vsak gen[2].
=== Visokofrekvenčni kodoni  ===
Deoptimizacija parov kodonov (CPD) je učinkovita tehnika atenuacije virusa. Končni cilj zamenjave kodonov je povečati število premalo zastopanih parov kodonov v genih virusa. Študija je zagotovila informacije o parih kodonov, ki se pogosto pojavljajo, in o manj pogostih kodonih. Analiza je pokazala, da so med prvimi 20 najbolj zaželenimi pari kodonov ACT- (treonin), AAT- (asparagin), TTT- (fenil alanin) in TTG- (levcin) kodoni v vsaj treh genih od štirih. Po drugi strani pa so imeli GTT- (Val), GGA-(Gly) in CTT-(Leu)kodoni prednost v vsaj dveh genih.

=== Redki kodoni ===
Kodoni CGG (Arg), CCG (Pro) in CAC (His) so bili redki v vseh genih. Kodoni GGG (Gly), CCC (Pro) in TCG (Ser) so bili redki v vsaj treh genih. Kodon CAA se zelo uporablja v NP (>5 % vseh kodonov), medtem ko se uporablja manj kot 1 % v genih E in S [2].
=== Preferenca kodonov strukturnih genov in nabor človeške tRNA ===
Študija je pokazala, da se med vsemi aminokislinami le prednostni kodon za ILeu ujema z najbolj razširjenimi izoakceptorskimi tRNA v človeških gostiteljih. Razen za Ileu so se le štiri aminokisline, in sicer Phe, Leu, Ala in Tyr, ujemale z bogato izoakceptorsko tRNA za njihove prednostne kodone v treh od štirih preučevanih genov. Ugotovitve so pokazale, da prednostni kodoni strukturnih genov delta različice SARS-CoV-2 niso v skladu z obilnim naborom tRNA, ki je prisoten v človeškem telesu [2].
=== Oblikovanje kandidata za cepivo ===
Na podlagi analize genov so avtorji skonstruirali tri kandidate za cepivo in te konstrukte so sistemsko analizirali glede sposobnosti virusa.
Prvi konstrukt je temeljil na informaciji, da so sekvence bogate z dinukleotidi TT in AA, slabljenje pa je povezano s povečanjem vsebnosti TA in zmanjšanjem dinukleotidov TpT in ApA. Zato so rekodirali tri preveč zastopane kodone, ki vsebujejo TT (kodoni CTT, GTT in CTT), in jih nadomestili s kodoni, ki vsebujejo TA, ki se redko pojavljajo.
Med načrtovanjem drugega konstrukta so nadomestili številne kodone z redkimi kodoni (CGG (Arg), CCG (Pro), CAC (His) GGG (Gly), CCC (Pro) in TCG (Ser)).
V tretjem konstruktu so prekinili prednostne pare kodonov na 5' koncu.<br />
Študija je ocenila tri parametre za oceno sposobnosti konstruiranega virusa: CAI (angl. Codon Adaptation Index), CPS (angl. Codon Pair Score) in stabilnost mRNA. Konstrukt z redkimi kodoni je imel najvišjo stabilnost mRNA, vendar najnižje rezultate CAI in CPS. Konstrukt s kodoni, ki se končajo s TA, je imel nizko stabilnost mRNA, vendar so rezultati CAI in CPS podobni divjemu tipu. Prekinitev prednostnih kodonskih parov je povzročila zmanjšano izražanje proteinov, nizek CPS in nizko stabilnost mRNA. Na podlagi analize je bilo ugotovljeno, da je tretji konstrukt, ki je uvedel redke kodone za motenje favoriziranih kodonskih parov, najprimernejši kandidat [2].
== Zaključek ==
Raziskovalci so preizkusili tri strategije, za oblikovanje oslabljenega cepiva proti različici delta SARS-CoV-2 z uporabo pristopa sintetične biologije vključno s spremembo TpT v TpA, uvedbo redkih kodonov in prekinitev favoriziranih kodonov. Ugotovili so, da je namesto vključevanja redkih kodonov, prekinitev priljubljenih parov kodonov bolj izvedljiva strategija pri pridobivanju boljših kandidatov za cepivo zaradi zmanjšane ekspresije proteinov in manjše stabilnosti transkripta.

== VIRI ==
[1] Shiehzadegan, S., Alaghemand, N., Fox, M., & Venketaraman, V. (2021). Analysis of the Delta Variant B.1.617.2 COVID-19. Clinics and Practice, 11(4), 778–784. https://doi.org/10.3390/clinpract11040093. <br />
[2] Gurjar, P., Karuvantevida, N., Rzhepakovsky, I. V., Khan, A. A., & Khandia, R. (2023). A synthetic biology approach for vaccine candidate design against delta strain of sars-cov-2 revealed disruption of favored codon pair as a better strategy over using rare codons. Vaccines, 11(2), 487. https://doi.org/10.3390/vaccines11020487. <br />
[3] Yadav, R., Chaudhary, J. K., Jain, N., Chaudhary, P. K., Khanra, S., Dhamija, P., Sharma, A., Kumar, A., & Handu, S. (2021). Role of structural and non-structural proteins and therapeutic targets of sars-cov-2 for covid-19. Cells, 10(4), 821. https://doi.org/10.3390/cells10040821. <br />
[4] Atkinson, N. J., Witteveldt, J., Evans, D. J., & Simmonds, P. (2014). The influence of CpG and UpA dinucleotide frequencies on RNA virus replication and characterization of the innate cellular pathways underlying virus attenuation and enhanced replication. Nucleic Acids Research, 42(7), 4527–4545. https://doi.org/10.1093/nar/gku075.