ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s C. difficile

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
(Komponente sistema ProQuorum)
(Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v E. coli))
Line 23: Line 23:
= Testiranje delovanja =
= Testiranje delovanja =
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==
== Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v ''E. coli'') ==
-
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina, optimalno izločanje endolizina iz celice in optimalna učinkovitost endolizina proti ''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L je sledilo testiranje delovanja in učinkovitosti endolizina.  
+
Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic ''C. difficile''. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanja''C. difficile''. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina.  
-
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1  (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer se je opazilo spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja.  
+
Zaradi varnosti, so delali teste na celicah ''Bacillus subtilis'', ki so bakterije kategorije 1  (''C. difficile'' spada v kategorijo 2). Ker ima ''B. subtilis'' podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot ''C. difficile'', so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja.  
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.
V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na ''B. subtilis'' s primerjavo učinkov na ''E. coli, B. subtilis'' in ''L. reuteri''. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri ''C. difficile''.

Revision as of 18:49, 20 April 2020

ProQuorum je projekt iGEM 2019 študentov iz Univerze v Oxfordu. Ekipa je želela narediti zdravilo proti bakterijski okužbi s C. difficile, ki bi nadomestilo zdravljenje z antibiotiki. Izkoristili so lasten sistem C. difficile za zaznavanje celične gostote, ga prenesli v celice L. reuteri in tako naredili senzor za okužbo s C. difficile, ki v primeru okužbe prepreči razmnoževanje C. difficile v telesu. Spletna stran projekta ProQuorum, iGEM 2019, Oxford: https://2019.igem.org/Team:Oxford

Contents

Okužba s Clostridioides difficile

Bakterija Clostridioides difficile je eden najpogostejših vzrokov za bolnišnične okužbe v ZDA in Evropi. C. difficile je Gram pozitivna anaerobna bakterija, ki obstaja tudi v obliki odpornih spor. Anaerobni patogen se razmnožuje v tankem črevesju najraje pa kolonizira predvsem spodnje dele črevesja. Dejavniki tveganja za okužbo so starost, pridružene bolezni, zmanjšana imunska odpornost in jemanje antibiotikov, saj je takrat naravna črevesna mikroflora okrnjena. Glavni simptomi bolezni so driska, povišana telesna temperatura, bolečine v trebuhu, slabost, v hujših primerih pa potencialno tudi smrt [1, 2]. C. difficile ima dva virulenčna faktorja, toksin A (TcdA) in toksin B (TcdB). Enterotoksin TcdA vpliva na črevesni epitelij, izločanje tekočine, vnetje, nekrozo tkiva, TcdB pa je nevaren citotoksin [3].

Zdravljenje okužbe s C. difficile

Zdravljenje okužbe s C. difficile je odvisno od stanja in resnosti bolezni. V primeru blagih simptomov je treba prenehati z jemanjem antibiotikov, saj močno oslabijo črevesni mikrobiom, kar odporna bakterija C. difficile izkoristi in se lažje naseli v črevesnem lumnu. Če gre za hujšo obliko bolezni pa se predpišejo ustrezni antibiotiki, kot so metronidazol, vankomicin in fidaksomicin [1, 2]. Ker je odpornost na antibiotike vse večja težava današnjega zdravstva, prav tako pa antibiotiki negativno vplivajo na črevesno mikrobioto, se je študentska ekipa Oxforda odločila za drugačno rešitev – sistem ProQuorum.

ProQuorum

Člani projekta Proquorum so si zamislili sinteznobiološko rešitev, ki bi lahko nadomestila antibiotike pri zdravljenju okužbe s C. difficile. Pripraviti so želeli probiotik, ki bi deloval kot senzor, pri čemer so kot šasijo uporabili celice Lactobacillu reuteri. Gre za sistem zaznavanja celične gostote celic C. difficile v črevesnem lumnu. Po detekciji patogena pride do aktivacije senzorja, sproži se postopek za uničenje bakterij C. difficile (BBa_K3183300) [4].

Detekcijski/regulatorni sistem

Bakterije C. difficile uporabljajo Arg sistem za zaznavanje celične gostote (»quorum sensing«). Transmembranski protein ArgB procesira prepeptid ArgD, da nastane signalna molekula AIP (»autoinducer peptid«), ki se izloči iz celice. Ko se celice dovolj namnožijo, naraste zunajcelična koncentracija AIP, ki se veže na membrano vezan receptor histidin kinazo ArgC. Ob vezavi AIP pride do avtofosforilacije ArgC ter posledične fosforilacije ter dimerizacije proteina ArgA. Dimer ArgA je aktivna oblika proteina, ki deluje kot transkripcijski fakotor za aktivacijo promotorja Arg, ki vpliva tudi na izražanje toksinov. Celice začnejo ob povečanju celične gostote sintetizirati TcdA in TcdB, ki sta odgovorna za simptome okužbe s C. difficile [3].

Sistem ProQuorum deluje tako, da celice L. reuteri preko signalnih molekul AIP zaznajo porast števila patogenih bakterij C. difficile [4]. Molekula AIP preko dvokomponentnega detekcijskega sistema ArgC/ArgA v L. reuteri inducira sintezo in sekrecijo za C. difficile specifičnega endolizina, ki cepi celično steno C. difficile. Endolizin CD27L, izpeljan iz bakteriofaga ΦCD27L, je N-acetil-muramil-L-alanin amidaza, ki specifično prepozna glikopeptide celične stene C. difficile in cepi amidne vezi, kar sproži razgradnjo peptidoglikanske celične stene. Zaradi osmoze celica posledično lizira [5, 6]. Izbira takšne aktivne molekule omogoča močno in tarčno lizo patogenih celic C. difficile, hkrati pa ne poškoduje človeške črevesne mikroflore.

Izbira "šasije"

Kot "šasijo" svojega vezja so izbrali bakterijo Lactobacillus reuteri, ki lahko deluje neposredno na mestu okužbe, v črevesju. Lactobacillus je rod, ki je dobro adaptiran na rast v človeškem črevesju in je znan kot varnen probiotiki, kar je bila dodatna prednost izbire. L. reuteri izloča antimikrobno molekulo reuterin, ki inhibira rast škodljivih črevesnih mikroorganizmov, koristne bakterije pa ostanejo nedotaknjene. Poleg tega ima L. reuteri intrinzično rezistenco na metrodinazol, vanocimin in fidoamicin, celice pa so odporne na razgradnjo z endolizinom CD27L. Kot C. difficile je tudi L. reuteri Gram-pozitivna bakterija, kar omogoča izražanje funkcionalnega transmembranskega receptorja ArgC za detekcijo [4, 5].

Komponente sistema ProQuorum

V celice L. reuteri, so želeli vstaviti zapis za dvokomponentni detekcijski sistem za AIP, ArgC/ArgA (BBa_K3183004, BBa_K3183005) in zapis za endolizin CD27L (BBa_K3183017). Endolizin se iz celic izloči preko poti Sec zaradi sekrecijske oznake slpMOD (BBa_K3183008), ki je kot fuzija pripeta na endolizin. Oznaka je bila razvita posebej za komenzalne bakterije Lactococcus lactis in Lactobacillus johnsonii, zato je primerna tudi kot sekrecijska oznaka za Lactobacillus reuteri. Posamezne biokocke so združevali z metodo "Gibson Assembly". Zapis za komponente sistema so v celice vstavili preko ekspresijskega vektorja za L. reuteri, pTRKH3 (BBa_K3183050).

Testiranje delovanja

Delovanje in učinkovitost endolizina (testi v E. coli)

Endolizin CD27L je ključna komponenta sistema ProQuorum, saj je je odgovorna za lizo celic C. difficile. Zahteve sistema ProQuorum so: optimalno izražanje endolizina in izločanje endolizina iz celice ter čim boljša učinkovitost uničevanjaC. difficile. Po uspešnem izražanju konstukta z zapisom za cel endolizin CD27L so testirali delovanje in učinkovitost endolizina.

Zaradi varnosti, so delali teste na celicah Bacillus subtilis, ki so bakterije kategorije 1 (C. difficile spada v kategorijo 2). Ker ima B. subtilis podobno sestavo peptidoglikanske celične stene kot C. difficile, so lahko dobljene rezultate kvantificirali (merjenje OD600). Celični lizati z dodanim endolizinom so imeli nižjo celično gostoto. Delovanje endolizina CD27L so preverili tudi kvalitativno z uporabo elektronske mikroskopije SEM, kjer so opazili spremembe celične stene, vdolbine in razpoke, kot posledica porušene strukture peptidoglikanskega ogrodja.

V nadaljevanju so dokazovali specifičnost delovanja endolizina CD27L na B. subtilis s primerjavo učinkov na E. coli, B. subtilis in L. reuteri. Po pričakovanjih, se je ob dodatku endolizina gostota celic (OD600) opazno zmanjšala le pri C. difficile.

Prenos konstruktov v L. reuteri

Transformacijo genetskega materiala preko plazmida pTRKH3 so naredili z elektroporacijo, ki je standardna metoda transformacije za Lactobacillus spp.. V literaturi je zapisanih kar nekaj različnih protokolov elektroporacija za L. reuteri, vendar študentski ekipi kljub večim poskusom ni uspelo tranformirati L. reuteri tipa DSM20016 . Kasneje so ugotovili, da je treba za uspešno tranformacijo uporabiti plazmidno DNA izolirano iz L. lactis, ne pa iz E. coli, saj ima plazmid pridobljen iz L. lactis ustrezen metilacijski vzorec, ki ga gostiteljska bakterija ne razgradi [4, 7]. Ker na tisti stopnji projekta niso imeli možnosti pomnoževanja plazmidne DNA v L. lactis so uporabili drug sev L. reuteri 100-23c in nov protokol tranformacije, ki je uspela [3, 6].

Izražanje endolizina CD27L v L. reuteri

Izražanje endolizina CD27L v L. reuteri so preverjali s konstruktom SlpMod-CD27L pod kontrolo konstitutivnega promotorja erm, na katerem je tudi zapis za reporter mClover3 (pridobljen iz GFP), ki se prepisuje sočasno z endolizinom, vendar nista fuzirana (BBa_K3183103). Preverjali so, če izražanje endolizina CD27L v L. reuteri povzroča celični stres in tako inhibira rast celic. Hitrost rasti celic z zapisom za CD27L se je zmanjšala za 19 % v primerjavi z divjim tipom. Sedile so meritve fluorescence reporterja mClover3 in določevanje ravni izražanja proteina. Ugotovili so, da verjetno prihaja do neke negativne povratne zanke, kot odziv na celični stres, ki zmanjša izražanje endolizina CD27L, posledica česar je tudi relativno nizko zmanjšanje hitrosti rasti celic. Uporabili so tudi fluorescenčno mikroskopijo: fluorescenca signala mColver3 v celicah s konstruktom SlpMod-CD27L je bila šibka, prav tako pa je bil signal skoncentriran v diskretnih točkah po celicah, precej podobnim inkluzijskim telescem. Detekcija endolizina z wetern blot-om preko protiteles anti-6His ali metode SpyCatcher je bila neuspešna [4].

Izražanje ArgAC v L. reuteri

Sestavljeni biodel ArgAC (BBa_K3183102) pod kontrolo konstitutivnega promotorja slp so prav tako vstavili v plazmid pTRKH3. Protein ArgA je imel dodano fuzijsko oznako SpyTag, ArgC pa HA, imela sta vsak svoj RBS, med zapisoma pa ArgA (BBa_K3183004) in ArgC (BBa_K3183005) pa je bil spacer. Delovanje vezja so želeli preveriti preko reporterskega sistema. Dodatek AIP bi aktiviral ArgA transkripcijski faktor, ta pa bi sprožil sintezo reporterskega proteina mClover3 pod kontrolo promotorja ArgA2 (BBa_K3183104).

Tudi v primeru izražanja ArgAC je prišlo do podobnih problemov kot pri endolizinu CD27L. Proteinov niso detektirali ne s protitelesi, ne s SpyCatcher detekcijo. Razlog za slabo izražanje je lahko slabo zvijanje proteinov, zmanjšanje izražanje zaradi celičnega stresa ali pa šibka aktivnost promotorja slp v L. reuteri. Promotor slp so izbrali ravno zaradi nizke aktivnosti, saj so se želeli izogniti preveliki koncentraciji proteinov v celici [4].

Zaradi neuspeha na tej stopnji niso mogli nadaljevati s testi induciranega izražanja endolizina CD27L pod kontrolo promotorja ArgA2 (BBa_K3183003), saj v celicah L. reuteri niso uspeli pripraviti senzorja za AIP, ArgAC. Dodaten problem je predstavljala tudi kemijska identiteta signalne molekule AIP, ki bi bila potrebna za indukcijo sistema, saj se rezultati masne spektrometrije ESI niso skladali s podatki iz literature [4].

Vpogled v zdravilo

Matematično modeliranje je imelo pomembno vlogo pri razvoju dizajna in delovanja probiotika ProQuorum. Naredili so matematični model populacijske dinamike L. reuteri in C. difficile, da so določili čas v katerem mora biti probiotik zaužit za optimalen terapevtski učinek. V modelu so predpostavili, da sta populaciji v črevesju C. difficile in L. reuteri popolno pomešani in da črevesje zagotavja dovolj nutrientov, da ni kompeticije za nutriente. Računalniška simulacija je pokazala, da probiotik ne more uničiti celotne okužbe s C. difficile, jo pa omeji in ustavi v mirujočem stanju. Dokazali so tudi, da je treba probiotik zaužiti približno 26 h preden se začnejo celice C. difficile širiti in razmnoževati, da se sinteza toksina ne sproži. To pomeni, da bi probiotik najbolje služil kot preventiva proti okužbi s C. difficile [4].


Zaključek

S projektom so študentje dokazali, da ima uporaba sistema zaznavanja celične gostote velik potencial v medicini. Čeprav je ostalo še veliko nerazrešenih problemov za prihodnost, ima probiotik ProQuorum velik potencial kot preventiva proti okužbi s C. difficile in dobra alternativa antibiotikom.


Viri

  1. L. Heinlen, J. D. Ballard. Clostridium difficile infection. Am J Med Sci. 2010, 340, 247–252.
  2. M. J. Mayer, et al. Molecular characterization of a Clostridium difficile bacteriophage and its cloned biologically active endolysin. Journal of Bacteriology. 2008, 20, 6734–6740.
  3. C. Darkoh, H. L. DuPont, S. J. Norris, H. B. Kaplan. Toxin synthesis by Clostridium difficile is regulated through quorum signaling. mBio. 2015, 6.
  4. iGEM 2019 team Oxford. ProQuorum. 18.4.2020. [citirano 20.4.2020] https://2019.igem.org/Team:Oxford
  5. M. J. Mayer, et al. Structure-based modification of a Clostridium difficile-targeting endolysin affects activity and host range. Journal of bacteriology. 2011, 193, 19.
  6. A. Fernandez, et al. Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by Lactococcus lactis. Applied and Environmental Microbiology. 2008, 75, 869–871.
  7. J. K. Spinler et al. Next-generation probiotics targeting Clostridium difficile through precursor-directed antimicrobial biosynthesis. Infection and Immunity. 2017, 85, 10.
  8. T. W. Aukrust, M. B. Brurberg, I. F. Nes. Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods Mol. Biol. 1995, 47, 201-208.
Personal tools