Produkcija lipidnih biogoriv s sintezno biologijo

CO2 V NAŠI ATMOSFERI

Prisotnost CO2 v naši atmosferi od začetka uporabe fosilnih goriv konstantno narašča, v letu 2013 je vsebnost le tega znašala 142% CO2 pre-industrijske dobe (leta 1750). Vsebnost CO2 je med letoma 2012-2013 naraščala najhitreje od leta 1984 (WMO, 2014), nov rekord pa je bil ponovno dosežen v letu 2014 (WMO, 2015). Ena četrtina vseh svetovnih emisij CO2 prihaja z izpustov vozil po uporabi tekočih goriv. Produkcija fosilnih goriv pa zaradi povečanega povpraševanja in posledično izčrpavanja virov znižuje za 4-5% letno (Nigam in Singh, 2011). Zaradi teh vzrokov se pojavlja potreba po novem,obnovljivem viru energije, zaželjeno iz rastlin ali organskih odpadkov (Naik et al., 2010).

BIOGORIVA PRVE GENERACIJE

Biogoriva predstavljajo alternativo klasičnim fosilnim gorivom, saj je njihov prispevek k izpustom CO2 v atmosfero mnogo nižji. CO2, ki nastaja pri porabi biogoriv se namreč porabi pri rasti biomase s fotosintezo, ki je kasneje uporabljena za produkcijo biogoriv (d'Espaux et al, 2015). Države Evropske Unije so podpisale direktivo, ki od članic zahteva 20% delež porabe energije iz obnovljivih virov do leta 2020, od tega 10% za transportna goriva. Danes je le 2% vseh transportnih goriv biogoriv. Najbolj razširjeni vrsti biogoriv danes sta etanol in boidizel (alkilni ester maščobnih kislin –FAAE). Bioetanol je danes daleč najbolj pogosto biogorivo, pridobivamo pa ga z mikrobno fermertacijo sladkorjev. Žal lahko etanol zaradi svoje nizke energijske vrednosti predstavlja največ 10% gorivne mešanice, tako da ga je potrebno mešati z bencinom. V ZDA je ta 10% prag že dosežen. Biodisel, kot je poimenovan alkilni ester maščobnih kislin (FAAE), se pridobiva s termo kemično esterifikacijo rastlinskih olj z alkoholom (etanolom ali metanolom). FAAE se od dizla in bencina strukturno razlikuje, saj je sestavljen iz metil- ali etil-esrerskih linearnih C16-C22 alkilnih verig (d'Espaux et al, 2015). Letno se pridela skoraj 50 miliard litrov biogoriv prve generacije (Naik et al, 2010). Glavna ovira za širšo proizvodnjo biogoriv prve generacije je potreba virov, primernih za prehrano, za produkcijo le-teh (food vs fuel dilema) (Searchinger et al, 2008), saj se npr za produkcijo FAAE uporabljajo rastlinska olja, primerna za prehrano (d'Espaux et al, 2015).

BIOGORIVA DRUGE GENERACIJE IN LIPIDNA BIOGORIVA

Rešitev so biogoriva druge generacije, za katere bi idealno potrebovali gensko spremenjene mikroorganizme, ki bi cenen začetni material pretvorili v biogorivo. Ena od možnosti za nova biogoriva je uporaba lipidov kot biogoriv. Lipidi so naravno energentsko bogate molekule, ki jih večina organizmov uporablja za shranjevanje energije. Zanimivo je, da so tudi strukturno precej podobni obstoječim gorivom, ogljikovim hidratom. Gene za pretvorbo lipidnih produktov biosinteze (npr maščobnih kislin ali acil tioestrov) v produkte, ki jih lahko uporabimo kot biogoriva lahko s tehnikami rekombinantne DNA vstavimo v gostiteljske organizme (npr E. coli), ki ob dodatku ustreznega substrata (npr glukoze) pretvorbo izvedejo. V prihodnosti bodo morda prisotni organizmi, ki bodo rasli na cenenih substratih, kot je celuloza, ali celo metan ali CO2. Lipidi, ki jih lahko uporabimo za biogoriva, v organizmih nastajajo v dveh metabolnih poteh: preko biosinteze maščobnih kislin in biosinteze izoprenoidov (d'Espaux et al, 2015).

BIOSINTEZA MAŠČOBNIH KISLIN

Pri metabolni poti biosinteze maščobnih kislin so končni produkti acil tioestri, vezani na koencim A (CoA), pri sesalcih in glivah ali acil vezavni protein (ACP), pri večini bakterij. Po biosintezi se pri naravni poti metabolizma acil tioestri porabijo pri sintezi membranskih fosfolipidov ali triacilglicerido v (TAG) kot shramba energije (d'Espaux et al, 2015). Iz aciltioestrov lahko proizvedemo različne produkte, ki jih lahko uporabimo kot biogoriva. FAAE je molekularno identičen FAAE gorivu iz prve generacije biogoriv, pridobljenem iz rastlinskih olj. V E coli so ga proizvedli z heterolognim izražanjem voskaste ester sintaze (WS) (dolgo verižna alkohol O-maščobna-aciltransferaza), ki katalizira esterifikacijo acil tioestra z etanolom. Iz acil tioestrov lahko proizvedemo tudi alkane in alkene: uporabljena je bila redukcija acil tioesrov (in prostih maščobnih kislin) v maščobne aldehide, ki ji je sledila dekarbonilacija. Možna je tudi direktna dekarboksilacija prostih maščobnih kislin v α-alkene z bakterijskim citokromom P450 ali poliketidsintaza (PKS) medirana dekarboksilacija. Proizvedemo lahko tudi biomolekule, ki trenutno niso uporabljene kot goriva (maščobne alkohole, metil ketone, hikdoksi in karboksilne kisline), imajo pa obetajoče lastnosti kot goriva. Različni encimi, ki jih uporabimo, imajo različne potrebe za substrat. Možna pa je produkcija zelo razvejanih produktov, kar izboljša učinkovitost goriva na visoki nadmorski višini in pri nizki temperaturi (d'Espaux et al, 2015).

BIOSINTEZA IZOPRENOIDOV

Pri biosintezi izoprenoidov dobimo bolj razvejane produkte. Izoprednoidi (ali trepeni) so definirani s 5-karbonatnih izoprenov, ki se sestavijo v makromolekule, sestavljene iz tisočih osnovnih molekul in se sestavljajo 60% vseh poznanih naravnih materialov. Biosinteza izoprenoidov pri bakterijah poteka preko 1-deoksi-D-ksiluloze 5-fosfatne (DXP) poti in malvalonatne (MVL) poti pri evkariontih in arhejah. Obe poti se srečata pri proizvodnji isopentenil fosfata IPP in dimetil fosfata DMAPP. Iz IPP in DMAPP nastajajo različni tipi trepenskih sintaz, ki sestavljajo tisoče različnih produktov (d'Espaux et al, 2015). Med izoprenoidi imajo C10 izoprenoidi–monoterpeni in C15 izoprenoidi–seskviterpeni primerne lastnosti za potencialna biogoriva. Monotrepene lahko proizvedemo s kondenzacijo IPP in DMAPP v geranil pirofosfatazo z GPP sintazo in kasneje še z drugimi monotrepenskimi sintazami. Te poti za proizvodnjo številnih monotrepenov (alfa-pinen, sabinen, limonen in geraniol) so bile uspešno vstavljene v produkcijske mikroorganizme. Seskviterpeni so proizvedeni s kondenzacijo dveh IPP in ene DMAPP molekule v farnezil pirofosfata (FPP) s FPP sintazo in nadaljnjo modifikacija s seskviterpenskimi sintazami. S sintetičnimi biopotmi v gostiteljskih organizmih sta bila proizvedena seskvitrepena bisabolen in α-farnesen (d'Espaux et al, 2015).

IZBOLJŠANJE PRODUKCIJE

Za izboljšanje ravni produkcije biogoriv v mikroorganizmih lahko uporabimo strategije metabolnega inženiringa. V tradicionalnem metabolnem inženiringu je pogosta uporaba 'pull-push-block' postopka. Gre za 'pull-vlečenje' biokemijske poti, da povečano izraža encim, ki nas zanima, v kombinaciji s 'push-potiskanjem' poteka sinteze: premagovanje ozkih grl in 'block-blokiranjem' ne esencialnih delov metabolne poti z delecijo genov, ki katalizirajo neželene reakcije (d'Espaux et al, 2015). Te strategije se dajo učinkovito uporabiti za izboljšanje produkcije biogoriv v mikroorganizmih. Pri biosintezi maščobnih kislin je prisotno ozko grlo ob karboksilaciji acetil-CoA z ACC (acetil CoA karboksilaza). V E. coli je akvitnost ACC inhibirana s produktom acil-ACP. To inhibicijo lahko ustavimo s pretvorbo acil-ACP v druge produkte, ki karboksilacije ne blokirajo (d'Espaux et al, 2015).

SINTEZNA BIOLOGIJA ZA PRODUKCIJO BIOGORIV

S sintezno biologijo lahko produkcijo biogoriv v mikroorganizmih še izboljšamo. Orodja, ki so nam na voljo so optimizacija kodonov, usmerjena evolucija, sekvenciranje encimskih knjižnic in vključevanje ne naravnih aminokislin, med drugimi. Potrebno pa je boljše razumevanje bioloških sistemov, da bomo te potenciale lahko v celoti izkoristili, saj lahko neprimerno izražanje encimov prekine metabolizem ali spremeni produkcijo produktov ali kofaktorjev. Za ekspresijo genov v gostiteljskih organizmih lahko vstavimo orodja sintezne biologije: vezavna mesta za ribosome (RBS), promotorje, trans-aktivne akrivatorje, senzorje in stikala, encimske fuzije, lokalizacijske oznake in druge genetske dele. Ti deli morajo biti vstavljeni, da lako sestavimo kompleksen sistem za produkcijo želenega produkta. S temi načini lahko naravno gostiteljsko celico spremenimo v zelo izboljšan sintezni organizem (d'Espaux et al, 2015). V nedavni raziskavi so želeli proizvesti mikroorganizem za produkcijo biogoriva iz lignocelulozne biomase. Pripravili so E. coli, ki izraža celulazi β-1,4-endoglukanazo in β-1,4-glukozidazo pod močnim konstitutivno aktivnim promotorjem (gapA) in celulazi izloča v izven celični prostor. Izmerili so, da sev pretvarja fermentiran pšenični hidrolizat z glukozo, ksilozo in celobiozo v etanol z 85% učinkovitostjo. Ta sev je tako obetavno orodje za produkcijo lignoceluloznega bioetanola (Kim et al., 2015).

Viri

World Meteorological Organisation, 9.9.2014; https://www.wmo.int/pages/mediacentre/press_releases/pr_1002_en.html, (8.1.2016) World Meteorological Organisation, 9.11.2015, https://www.wmo.int/media/content/greenhouse-gas-concentrations-hit-yet-another-record (8.1.2016) D’ESPAUX, L. M.-P., DANIEL; LI, RACHEL; KEASLING, JAY D 2015. Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels. Current Opinion in Chemical Biology, 29, 58-65. KIM, K. H., MUNJAL, N., JAWED, K., WAJID, S. & YAZDANI, S. S. 2015. A Constitutive Expression System for Cellulase Secretion in Escherichia coli and Its Use in Bioethanol Production. Plos One, 10, e0119917. NAIK, S. N. G., VAIBHAV V.; ROUT, PRASANT K.; DALAI, AJAY K.. I. 2010. Production of first and second generation biofuels: A comprehensive review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 14, 578-597 NIGAM, P. S. S., ANOOP 2011. Review: Production of liquid biofuels from renewable resources. Progress in Energy and Combustion Science, 37, 52-68. GEORGIANNA, D. R. & MAYFIELD, S. P. 2012. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature, 488, 329-335.