Programabilni sintetični biomolekulski kondenzati za nadzor celičnih procesov: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
Line 8: Line 8:


===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
===Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v ''E. coli''===
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLP<sub>WT</sub>). Fuzije RLP<sub>WT</sub>–DBD in RLP<sub>WT</sub>–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLP<sub>WT</sub>–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLP<sub>WT</sub>–DBD in samim RLP<sub>WT</sub>. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni in vitro ter in vitro [3].
Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v ''E. coli'' je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLP<sub>WT</sub>). Fuzije RLP<sub>WT</sub>–DBD in RLP<sub>WT</sub>–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLP<sub>WT</sub>–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLP<sub>WT</sub>–DBD in samim RLP<sub>WT</sub>. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni ''in vivo'' ter ''in vitro'' [3].


===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===
===Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz===

Revision as of 09:10, 17 May 2023

Povzeto po članku: Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. Nat. Chem. Biol. 2023, 19(4), str. 518-528.

Uvod

Kompartmentalizacija predstavlja eno ključnih vlog pri razvoju evkariontske celice. Znotrajcelični organeli oz. kompartmenti, obdani iz lipidno membrano, omogočajo ustvarjanje lokalnih pogojev za določen celični proces. Poleg klasičnih organelov so v celici prisotni tudi prehodni, začasni skupki nagnetenih molekul, ki sicer spominjajo na membranske organele, le da niso obdani z lipidno membrano. Imenujemo jih biomolekulski kondenzati in nastanejo zaradi združevanja bioloških makromolekul (proteinov in nukleinskih kislin) [1]. Biomolekulski kondenzati sodelujejo v različnih celičnih procesih, od regulacije genov do regulacije celičnega stresa. Inženiring umetnih biomlekulskih kondenzatov omogoča boljše razumevanje organizacije le-teh in sintezo umetnih sistemov z novimi funkcijami [2] Nastanek takih kondenzatov lahko poganja fazno ločevanje, povezano s perkolacijo/pronicanjem intrinzično neurejenih proteinov (PSCP) [3]. Intrinzično neurejeni proteini zaradi specifične aminokislinske sestave nimajo stalne tridimenzionalne strukture. V raztopini lahko hitro preklapljajo med različnimi energetskimi stanji [1]. Kondenzati lahko selektivno obogatijo ali osiromašijo biomolekule, kar omogoča nadzor nad celičnimi procesi. Sintetične kondenzate, ki jih tvorijo naravno prisotni intrinzično urejeni proteini, spojeni z različnimi funkcionalnimi domenami, so uporabili za nadzor celične proliferacije. Do sedaj so preučevali različne vzorce, ki vodijo fazno ločbo intrinzično neurejenih proteinov. Raziskovalna skupina v tem članku [3] pa je sintetizirala funkcionalne biomolekulske kondenzate z upoštevanjem do sedaj znanih pravil nastanka tovrstnih skupkov za preučevanje njihovega delovanja v celicah, in kako jih lahko uporabimo za nadzorovanje celičnih procesov [3].

Rezultati

Razvoj sintetičnih funkcionalnih kondenzatov

Z razvojem sintetičnih kondenzatov so želeli nadzorovati sekvestracijo plazmidov (ločevanje plazmidne DNA) in transkripcijo. Zasnovali so sintetične intrinzično urejene proteine (synIDP), ki so jih spojili skupaj s funkcionalnimi proteinskimi domenami. Raziskovali so različne dejavnike, ki prispevajo k nastanku kondenzatov. S pomočjo računalniškega modela so identificirali resilinu podobne polipeptide (RLP), kot potencialne molekule za nastanek kondenzatov. RLP izhajajo iz proteina resilin, ki ga najdemo v mušici Drosophila melanogaster. Da bi dosegli plazmidno sekvestracijo, so spojili protein ParB, ki veže DNA, skupaj z RLP-ji. Protein ParB reagira s specifičnim zaporedjem DNA in rekrutira plazmid. Fuzija proteina ParB z RLP (fuzija RLP–DBD in RLP–DBD–DD) je omogočila lokalizacijo ciljnega plazmida [1].

Modularna izgradnja sintetičnih kondenzatov v E. coli

Preučevanje izgradnje sintetičnih kondenzatov v E. coli je potekalo preko fuzije funkcionalnih domen (DBD in DD) na ponavljajoče se oktapeptide RLP divjega tipa (RLPWT). Fuzije RLPWT–DBD in RLPWT–DBD–DD tvorijo različne kondenzate, ki so jih opazili pri proučevanju s fluorescenčno mikroskopijo (konstrukte so spojili z monomernim GFP). Po indukciji ekspresije proteinov, se je s časom površina kondenzatov povečevala. Najhitreje so se oblikovali kondenzati fuzije RLPWT–DBD–DD, ki so tudi zasegli največ površine v primerjavi s fuzijo RLPWT–DBD in samim RLPWT. Za potrditev teh opažanj so uporabili diferencialno interferenčno kontrastno spektroskopijo (DIC), kjer so kondenzate neposredno opazovali (niso bili spojeni z mGFP kot pri fluorescenčni mikroskopiji). Tudi pri DIC so bila opažanja enaka. Izvedli so tudi poskuse in vitro ter in vitro, kjer so kondenzate izpostavili različnim pogojem. S testom posedanja so določili količinski prispevek posamezne domene k ločevanju faz. Ugotovitve kažejo, da so prispevki posameznih domen k ločevanju faz podobni in vivo ter in vitro [3].

Programiranje homotipskih in heterotipskih interakcij ločevanja faz

Naslednja stopnja je bila programiranje nastanka kondenzatov in nadzorovanje njihovih fizikalnih lastnosti z uporabo synIDP. Po preučitvi odzivnosti synIDP na različne dejavnike, so ugotovili, da kondenzati, ki jih tvori RLPWT, občutljivi na soli, spremembe v koncentraciji proteinov ipd. Da bi se temu izognili, so spremenili porazdelitev nabitih aromatskih aminokislinskih ostankov v zaporedju synIDP. Grozdenje aromatskih aminokislinskih ostankov je povečajo moč posameznih interakcij in omejilo mobilnost posameznih segmentov v kondenzatu. Nasprotno se je ob porazdelitvi nasprotno nabitih aminokislinskih ostankov povečalo število elektrostatskih interakcij; zmanjšala se je koncentracija nasičenja, ki je potrebna za tvorbo kondenzata. Specifične modifikacije lahko vplivajo na koeficiente difuzije in mobilnost znotraj kondenzatov. Ugotovili so, da dodatek domene DD dodatno zmanjša koeficient difuzije, kar kaže njegov vpliv na fizikalne lastnosti kondenzata [3]. Potrdili so prispevek heterotipskih interakcij k spodbujanju ločevanja faz. Preučevali so vpliv elementa DNA, ki vsebuje parS, na lastnosti kondenzatov. Prisotnost take DNA je vplivala na znižanje kritične koncentracije kondenzata, nastalega s fuzijo synIDP–dParB, kar je povzročilo ločitev faz in da je sintetični kondenzat ločil ciljno DNA. Povečanje števila mest parS na DNA je povzročilo nastanek večjih kondenzatov [3].

Lastnosti sintetičnih kondenzatov z DNA

Kondenzati imajo sposobnost sproženja asimetrične delitve plazmidov v E. coli. Fuzija RLPWT–DBD–DD in zaporedje parS sta bila kodirana v dveh različnih kompatibilnih plazmidih. Celice E. coli so gojili z in brez indukcije IPTG, uporabljena je bila kanamicinska selekcija. Indukcija RLPWT–DBD–DD je značilno zmanjšala število celic, ki so vsebovale oba plazmida, kar so potrdili s konfokalno mikroskopijo. Opazili so tudi, da je bilo v tem primeru zaporedje parS daleč od mesta ori. Kondenzati ustvarijo prostorski predel, ki vodi v asimetrično delitev plazmidov. Slednje so dokazali z uporabo kinetičnega modela [3].

Veliko plazmidov se lahko med bakterijskimi populacijami prenašajo s konjugacijo. Raziskovalci so predpostavili, da bi sintetični kondenzati lahko onemogočali tak prenos genov. Hipotezo so tudi potrdili s pomočjo sintetičnega konjugacijskega sistema [3].

Preučevali so tudi vpliv kondenzatov na aktivacijo transkripcije. Uporabili so kinetični model za primerjavo učinkov različnih komponent na transkripcijo. Model je predvideval, da lahko prisotnost kondenzatov poveča učinkovitost transkripcije. Uporabili so mutirani transkripcijski faktor SoxS(R93A), ki se ne more vezati na specifično zaporedje DNA in nima sposobnosti vpliva na izražanje genov. Za namen raziskave so ustvarili plazmid, ki je vseboval konstitutivni promotor in mesto parS, ki mu je sledilo tarčno zaporedje. S spojitvijo SoxS(R93A) s koaktivatorjem in tvorbo sintetičnega kondenzata so dosegli povečanje transkripcije. Opazili so namreč povečano izražanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP). Poleg tega so dokazali tudi, da je vključitev dodatnih vezavnih mest za parS na tarčnem plazmidu povečala izražanje genov. V primerjavi z običajno aktivacijo, ki je posredovana preko interakcije ključ-ključavnica, so ugotovili, da ima aktivacija transkripcije, ki je posredovana preko kondenzatov, večji vpliv na izražanje genov [3].

Študijo so razširili tudi na preučevanje učinkov, ki jih imajo sintetični kondenzati na aktivnosti v sesalskih celicah. Ustvarili so reporterski protein, ki je vseboval citrin fluorescentni protein, spojen z DHFR, ki vodi do razgradnje fuzijskega partnerja. Za nadzorovanje njegove aktivnosti so naredili fuzijo antiparalelne levcinske zadrge Czipper na N-koncu reporterskega proteina. Sintetizirali so sesalsko domeno synIDP, RLPS-Y, za nastanek sintetičnih kondenzatov. synIDP so spojili z drugo levcinsko zadrgo, Nzipper, da so lahko zagotovili nadzorovano združitev reporterskega proteina v kondenzate. V eksperimentih s celicami HEK293 so opazili, da je zaradi nastanka kondenzatov RLPS-Y-Nzipper prišlo do delne zaščite reporterskega proteina pred razgradnjo, kar je vodilo do ponovne fluorescence citrina. Pri celicah, ki so izražale samo RLPS-Y ali Nzipper, ni bilo razlike v fluorescenci (nezmožnost izražanja reporterskega proteina), medtem ko je sočasno izražanje RLPS-Y-Nzipper in reporterskega proteina omogočilo delno obnovitev fluorescence. S sintetičnimi kondenzati lahko tudi v sesalskih celicah uravnavamo aktivnost proteinov, tako da njihova uporaba predstavlja potencialno orodje za nadzor celičnih procesov [3].

Zaključek

V raziskavi [3] so predstavljeni novi načini nadzora celične aktivnosti. Prejšnje raziskave so slonele večinoma na principu »ključ-ključavnica«, pri čemer so uporabili proteine in ostale biomolekule, ki so bili ravno prave oblike za interakcije s specifičnimi tarčami. Vendar so dokazali, da celice ne morejo nadzorovati vseh procesov na tak način. Pakiranje biomolekulskih skupkov v celicah tvori obsežno in zapleteno mrežo biomolekul, tako da je posamezne mehanizme in interakcije težko nadzorovati s sledenjem ciljnim molekulam. Gensko kodirane synIDP, ki lahko preklapljajo med različnimi faznimi stanji, je moč uporabiti za načrtovanje funkcionalnih kondenzatov v živih celicah. S pomočjo takih biomolekularnih kondenzatov lahko raziskovalci ustvarijo kompartmente znotraj celic, ki ločujejo določene molekule od citosola. Te sintetične kondenzate se tako lahko uporablja za nadzorovanje celične aktivnosti. En primer uporabe je, da lahko z njihovo uporabo ustvarimo okolje znotraj celic, ki lahko selektivno obogati plazmide in s tem poveča učinkovitost transkripcije [3].

Literatura

[1] S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen: Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry. 2017, 18(5), str. 285-298.

[2] S. Do, C. Lee, T. Lee, D. N. Kim, Y. Shin: Engineering DNA-based synthetic condensates with programmable material properties, compositions, and functionalities. Sci. Adv. 2022, 8(41), str. 1–15

[3] Y. Dai, M. Farag, D. Lee, X. Zeng, K. Kim, H. in Son, X. Guo, J. Su, N. Peterson, L. You: Programmable synthetic biomolecular condensates for cellular control. Nat. Chem. Biol. 2023, 19(4), str. 518-528.