View source for Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema

Povzeto po članku: [https://academic.oup.com/nar/article/41/15/7429/2411254 Bikard D, Jiang W, et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Research. 2013, 41, 7429-7437.]

==Uvod==
Sposobnost umetnega nadzora transkripcije je bistvena tako za preučevanje funkcije genov, kot tudi za konstrukcijo sintetičnih genskih mrež z želenimi lastnostmi. Tehnologije rekombinantne DNA so napredovale pri študiju funkcije genov z razvojem sistemov, ki uporabljajo naravne mehanizme za uravnavanje njihovega izražanja. Ena izmed takšnih je uporaba transkripcijskih faktorjev, ki se vežejo na specifično DNA zaporedje pred genom in s tem modulirajo gensko izražanje. Pomanjkljivost le teh se skriva v dejstvu, da zahtevajo konstruiranje specifičnih promotorskih sekvenc, na katere se zatem vežejo regulatorji. Uporabljajo se tudi proteini z motivom cinkovih prstov in proteini TALE, katere reprogramirajo za vezavo na specifične sekvence DNA. Vendar ti zahtevajo precej časa in denarja, zato so Bikard in sodelavci iskali druge rešitve za modulacijo izražanja gena [1].

==CRISPR-Cas sistem==

Rešitev so našli v uporabi CRISPR-Cas sistema, vsem znanega protivirusnega imunskega sistema prokariontov. CRISPR je okrajšava za gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev, ki jih najdemo v genomu prokariontskih organizmov. Lokus CRISPR je torej sestavljen iz ponovitev in vmesnikov (angl. spacers), ki ustrezajo genomom virusov, ki so okužili dotični prokariont. Prepiše se v obliki prekurzorske crRNA, ki jo cepi RNAza III in se nato z tracrRNA veže na Cas endonukleazo. Zatem kompleks išče tarčne sekvence oziroma »protospacerje« na DNA, se na njih veže s protismernim zaporedjem in jih cepi [2]. 

Najbolj uporabljena in okarakterizirana je endonukleaza Cas9, kodirana s strani bakterije ''Streptococcus pyogenes'' in ima dve katalitični domeni, RuvC in HNH, kateri cepita po eno verigo na tarčni DNA. Za svoje delovanje oziroma vezavo pa mora biti na tarčni DNA, navzdol od »protospacerja«, prisotno tudi PAM zaporedje (zaporednje treh nukleotidov - NGG). 

Znana je tudi dCas9, tako imenovana mrtva Cas9, ki je katalitično neaktivna. To se dosegli z dvema ključnima mutacijama v domenah RuvC in HNH, pri katerih so aspartat na mestu 10 in histidin na mestu 840 mutirali v alanin. Tako spremenjena Cas9 se je še vedno zelo dobro vezala na tarčno DNA, ni pa bila več katalitično aktivna [1, 2].

==Namen raziskave==

Namen celotne raziskave je bilo preprečiti transkripcijo z vezavo dCas9 na promotorske regije, s čimer bi se preprečila vezava RNA polimeraze, preprečiti elongacijo z vezavo dCas9 na odprti bralni okvir ter pospešiti transkripcijo s pomočjo fuzije dCas9 z omega podenoto RNA polimeraze (že prej dokazano, da pospeši transkripcijo) [1].

==Kako so to izvedli in kakšne rezultate so dobili==

===Utišanje z dCas9===
Za prekinitev transkripcije so potrebovali protein, ki bi interagiral s promotorsko regijo ali odprtim bralnim okvirjem in fizično preprečil vezavo RNA polimeraze. Raziskovalci so se odločili za mutirano obliko Cas9 endonukleaze - dCas9, s čimer so dobili zelo dober programiran DNA vezavni protein. Zapis so vstavili v plazmid pdCas9, skupaj z tracrRNA in minimalnim lokusom CRISPR. Ta je vseboval vodilno zaporedje ter 2 ponovitvi, ločeni z vmesnikom, ki sta nosili dve restrikcijski mesti za BsaI, za lažje kloniranje novih vmesnikov in izražanje crRNA. Pri raziskavi so uporabili celice ''E.coli'' DH5α [1, 3]. 

Za preverjanje izražanja genov v ''E.coli'' z vezavo dCas9 na promotorske regije in odprt bralni okvir (ORF), so skonstruirali reporterski plazmid (pDB127), ki je vseboval ''gfp-mut2'' gen pod kontrolo promotorja, ki je vključeval več PAM zaporedij na obeh verigah. Nato so ustvarili 22 različnih vmesnikov, ki so tarčili različne regije ''gfp-mut2'' gena. Poimenovali so jih glede na to, na katero verigo so se vezali (T-nekodirajoča, B-kodirajoča) in zaporedno številko ter jih umestili na  plazmid pdCas9 prek restrikcijskih mest. Sledila je transformacija plazmidov v ''E.coli'' in merjenje. Po meritvi fluorescence so opazili več kot 100-kratno znižanje le-te pri tarčenju regij okoli promotorskih elementov -10 in -35, tako na kodirajoči kot nekodirajoči verigi. Pri tarčenju odprtega bralnega okvira je prišlo do znižanja fluorescence in s tem izražanja gena v 20-40 %, ko so ciljali nekodirajočo verigo in 6-35 %, ko so ciljali kodirajočo verigo [1]. 

Zatem so izvedli še prenos Northern s sevi, ki so izražali T5 (veže se na promotorsko regijo), T10 in B10 (vežeta se na zaporedje ORF) crRNA. Uporabili so sonde, ki so se vezale pred (P511) ali za (P510) tarčno zaporedje. Rezultati so se ujemali z meritvami fluorescence, saj se ''gfp-mut2'' ni prepisoval ob prisotnosti na dCas9 vezane T5 crRNA. Hkrati so po uporabi P510 sonde opazili nižjo raven izražanja pri tarčenju T10 ter B10 (tu se gfp-mut2 sploh ni izražal) vezavnih regij, ki pa se nahajata znotraj ORF. Zelo zanimivo je bilo, da so z uporabo P511 sonde pridobili manjše transkripte v velikosti okoli 250-300 nt, kar pa se ujema s pozicijo regij T10 in B10 na genu. S temi poskusi so torej potrdili domnevo, da vezava dCas9 na promotorske regije prepreči iniciacijo transkripcije, vezava na ORF pa prekine elongacijo. Hkrati se je izkazalo tudi, da dCas9 bolj prepreči transkripcijo, če ciljamo kodirajočo kot nekodirajočo verigo [1, 4].

Pri določenih aplikacijah bi potrebovali bolj natančno znižanje oziroma regulacijo transkripcije genov in ne popolne represije, zato so se raziskovalci osredotočili tudi na iskanje vmesnih stopenj modulacije transkripcije. To so dosegli z uvedbo neskladnosti med crRNA in tarčno sekvenco. Načrtali so serije vmesnikov (vzeli so seve, ki so izražali B1, T5 in B10 crRNA), dolgih 20 nt in v njih uvajali naraščajoče število mutacij na 5'-koncu. Te so nato vnesli v celice skupaj z dCas9 in jih ponovno vezali na ''gfp-mut2'' gen. Po merjenju fluorescence so ugotovili, da do 8 neskladnosti med B1 ali T5 crRNA ter tarčnim zaporedjem ne vpliva na utišanje transkripcije, medtem ko uvedba več neskladnosti že kaže postopno povišanje fluorescence. Pri B10 je že po uvedbi dveh neskladnosti prišlo do postopnega povišanja fluorescence, s čimer so dokazali, da je z uvajanjem neskladnosti mogoče uravnavati raven transkripcije po želji. Po več poskusih so prišli do zaključka, da je za popolno utišanje in vivo potrebnih 12 komplementarnih nukleotidov, in vitro pa 15 [1].

===Aktivacija z dCas9===

Aktivacijo transkripcije so preučevali na celicah ''E.coli'' KS1ΔZ, kjer je ''lacZ'' gen pod kontrolo šibkega konstitutivnega sintetičnega promotorja. Omenjeni sev nima ''rpoZ'' gena, ki kodira omega podenoto RNA polimeraze. Tu so se raziskovalci zanašali na prejšnje študije, ki so pokazale, da fuzija dCas9 in omega podenote RNA polimeraze deluje kot aktivator transkripcije, preko stabilizacije vezave RNA polimeraze na promotor. Uspeli so narediti plazmide z C- in N-končno fuzijo z omega podenoto ter štiri drugačne crRNA, ki so se vezale na različne regije promotorja ''lacZ'' gena. Vse so vstavili v celice in izmerili β-galaktozidazno aktivnost. Ugotovili so, da so učinki vezani na lokacijo vezavnega mesta – če je bilo to preblizu promotorju, je še vedno prišlo do utišanja. Bolj ko je bilo vezavno mesto oddaljeno od promotorja, večja je bila β-galaktozidazna aktivnost.

Zaradi zadnje ugotovitve so se odločili testirati vezavo crRNA na regije, ki so še bolj oddaljene od -35 promotorskega elementa. Tokrat so kot reporterski plazmid uporabili pWJ89, ki vsebuje ''gfp-mut2'' gen pod kontrolo šibkega promotorja iz biokocke. Med 10 testiranimi vezavnimi regijami, sta se kot najboljši izkazali mesti, kamor se vežeta W103 in W108 crRNA. Prvo je oddaljeno 43, drugo pa 53 nt od -35 promotorskega elementa in sta izkazali kar 7,2- oziroma 23-kratno povečanje indukcije. To nakazuje na dejstvo, da fuzija z dCas9 lahko najbolj pospeši transkripcijo ob vezavi na tarčno mesto, ki je na optimalni razdalji od promotorja. Zatem so testirali še, če ima pri aktivaciji transkripcije vlogo moč samih promotorjev. Vzeli so šibki, vmesni in močni promotor, ki so jih našli med biokockami. Ugotovili so, da močnejši kot je promotor, nižja je indukcija izražanja genov [1].

==Zaključek==

Z uporabo predstavljenih metod bi potemtakem lahko vodili dCas9 do katerekoli regije na bakterijskem kromosomu, s tem da bi morali zagotoviti specifično parjenje baz zaporedja crRNA in tarče. To lahko delamo, brez da bi morali spremeniti sekvenco promotorja gena, katerega izražanje želimo regulirati. Qi in sodelavci so tudi istega leta dokazali vlogo dCas9 kot represorja transkripcije, hkrati pa so sistem testirali tudi na človeških HEK293 celicah, kjer je tudi prišlo do vidnega utišanja izražanja. 
Zaključki, do katerih so prišli v izbranem raziskovalnem članku razkrivajo novo zmogljivo tehnologijo za uravnavanje izražanja genov v prokariontih. Z uporabo več vmesnikov v lokusu CRISPR, s katero bi proizvedli več crRNA, bi lahko vplivali na več genov hkrati in raziskovali organizacije genetskih mrež [1, 5].

==LITERATURA==

[1] Bikard D, Jiang W, et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Research. 2013, 41, 7429-7437.

[2] CRISPR. Pridobljeno na: https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR [dostopno dne 4.1.2019]

[3] pdCas9. Pridobljeno na: https://www.addgene.org/46569/ [dostopno dne 6.1.2019]

[4] Prenos Northern. Pridobljeno na: https://en.wikipedia.org/wiki/Northern_blot [dostopno dne 6.1.2019]

[5] Qi LS, Larson MH, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-speciﬁc control of gene expression. Cell. 2013, 152, 1173-1183.