Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

From Wiki FKKT
Revision as of 17:18, 11 March 2019 by Smalensek (talk | contribs) (New page: Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzo...)
(diff) ← Older revision | Latest revision (diff) | Newer revision → (diff)
Jump to navigationJump to search
The printable version is no longer supported and may have rendering errors. Please update your browser bookmarks and please use the default browser print function instead.

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva Prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα), v študijah na transgenih miših je to vodilo v »profilakso« pred srčno ishemijo ali ishemičnimi poškodbami jeter. Dodatek IL-37 mišim prepreči psoriazo, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic. Kot novo-odkriti protivnetni citokin predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni. Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije s sesalskimi patogeni / bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.

Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum

Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b: • Prekurzorska oblika: proIL-37b (celotna dolžina) pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi. • Zrela oblika: matIL-37b (brez nativnega signalnega peptida) Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER. • Fuzijski protein: SBA-IL-37b (fuzija z aglutininom iz soje) Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta. Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »triparental mating«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »agrobacterium-mediated leaf disc method«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo.

Karakterizacija produktov

Prenos Western vzorcev s proIL-37b je pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Pri matIL-37b in SBA-IL37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (19kDa), dimerne oblike ni bilo. Pri pro-obliki so dosegli zelo visoko izražanje (1% TSP), količina zrele oblike pa je bila precej nižja. Verjetno to nakazuje, da ER ni primerno mesto za lokalizacijo zrele oblike produkta (s humanim IL-4, IL-13, oranžnim fluorescenčnim proteinom je bilo pokazano, da lokalizacija v ER poveča izplen in stabilnost produkta). Pro-oblika je za razliko od zrele/fuzijske oblike ostala v citoplazmi – verjetno rastlinska celica ne prepozna nativnega N-končnega signalnega peptida, prisotnost slednjega pa je verjetno razlog večjemu izplenu pro-IL37b. Sumi se, da ima nativni signalni peptid stabilizacijsko vlogo. IL-37b je v splošnem nestabilni protein, saj vsebuje funkcionalne elemente mRNA za »nestabilnost«. Ti imajo vlogo negativne povratne zanke pri regulaciji izražanja mRNA/proteina, njihov izbris pa vodi v povečanje izražanja. Izplen matIL-37b so povečali s fuzijo s SBA na primerljiv nivo s pro-obliko (1% TSP). SBA je tetramerni glikoprotein, za katerega je značilna visoka stopnja stabilnosti. Kot fuzijski partner tako poveča nivo izražanja tarčnega proteina. Je lektin, ki se specifično veže na N-acetil-D-galaktozamin, kar olajša čiščenje produkta z afinitetno kromatografijo na agarozni koloni, povezani z izbranim sladkorjem. Ločitev tarčnega proteina od fuzijskega partnerja jim je omogočilo vmesno TEV-prepoznavno mesto in endoproteolitska restrikcija s proteazo TEV. Biološko aktivnost produktov so preizkušali in vitro na mišjih primarnih renalnih celicah iz epitela ledvičnega korteksa. Celice so podvrgli različnim koncentracijam IL-37b, kot standard so uporabili komercialni rekombinantni IL-37b in nato z endotoksinom LPS inducirali sintezo pro-vnetnih citokinov. V supernatantih kultur so nato analizirali koncentracijo TNF α. Sintezo slednje bi prisotnost IL-37b morala znižati. Tako matIL-37b kot tudi pro-IL37b sta biološko aktivna, zrela oblika toliko bolj zaradi neprisotnosti nativnega signalnega peptida – konformacijsko ugodnejša oblika pripomore k boljši vezavi na receptor.

Pomen študije