Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
(New page: Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzo...)
Current revision (19:22, 11 March 2019) (view source)
 
(9 intermediate revisions not shown.)
Line 1: Line 1:
-
Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva
+
Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako prooblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije provnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva<ref name="prvi">[https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019]</ref> <ref name="drugi">[https://doi.org/10.3892/ol.2018.7982 L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.]</ref>.
-
Prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα), v študijah na transgenih miših je to vodilo v »profilakso« pred srčno ishemijo ali ishemičnimi poškodbami jeter. Dodatek IL-37 mišim prepreči psoriazo, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic. Kot novo-odkriti protivnetni citokin predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni.
+
V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic<ref name = "prvi"/>.  
-
Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije s sesalskimi patogeni / bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.
+
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>
-
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>
+
 
-
Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija
+
<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>
-
V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b:
+
 
-
Prekurzorska oblika: proIL-37b (celotna dolžina)
+
V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.
 +
*Prekurzorska oblika: '''proIL-37b''', ''celotna dolžina''
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.
-
Zrela oblika: matIL-37b (brez nativnega signalnega peptida)
+
*Zrela oblika: '''matIL-37b''', ''brez nativnega signalnega peptida''
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.
-
Fuzijski protein: SBA-IL-37b (fuzija z aglutininom iz soje)
+
*Fuzijski protein: '''SBA-IL-37b''', ''fuzija z aglutininom iz soje''
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.
Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.
-
Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »triparental mating«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »agrobacterium-mediated leaf disc method«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo.
+
 
-
<h2>Karakterizacija produktov</h2>
+
Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens. Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo. Z vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo <ref name="prvi"/>.
-
Prenos Western vzorcev s proIL-37b je pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Pri matIL-37b in SBA-IL37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (19kDa), dimerne oblike ni bilo.
+
 
-
Pri pro-obliki so dosegli zelo visoko izražanje (1% TSP), količina zrele oblike pa je bila precej nižja. Verjetno to nakazuje, da ER ni primerno mesto za lokalizacijo zrele oblike produkta (s humanim IL-4, IL-13, oranžnim fluorescenčnim proteinom je bilo pokazano, da lokalizacija v ER poveča izplen in stabilnost produkta). Pro-oblika je za razliko od zrele/fuzijske oblike ostala v citoplazmi – verjetno rastlinska celica ne prepozna nativnega N-končnega signalnega peptida, prisotnost slednjega pa je verjetno razlog večjemu izplenu pro-IL37b. Sumi se, da ima nativni signalni peptid stabilizacijsko vlogo. IL-37b je v splošnem nestabilni protein, saj vsebuje funkcionalne elemente mRNA za »nestabilnost«. Ti imajo vlogo negativne povratne zanke pri regulaciji izražanja mRNA/proteina, njihov izbris pa vodi v povečanje izražanja.
+
<h3>Karakterizacija produktov</h3>
-
Izplen matIL-37b so povečali s fuzijo s SBA na primerljiv nivo s pro-obliko (1% TSP). SBA je tetramerni glikoprotein, za katerega je značilna visoka stopnja stabilnosti. Kot fuzijski partner tako poveča nivo izražanja tarčnega proteina. Je lektin, ki se specifično veže na N-acetil-D-galaktozamin, kar olajša čiščenje produkta z afinitetno kromatografijo na agarozni koloni, povezani z izbranim sladkorjem. Ločitev tarčnega proteina od fuzijskega partnerja jim je omogočilo vmesno TEV-prepoznavno mesto in endoproteolitska restrikcija s proteazo TEV.
+
 
-
Biološko aktivnost produktov so preizkušali in vitro na mišjih primarnih renalnih celicah iz epitela ledvičnega korteksa. Celice so podvrgli različnim koncentracijam IL-37b, kot standard so uporabili komercialni rekombinantni IL-37b in nato z endotoksinom LPS inducirali sintezo pro-vnetnih citokinov. V supernatantih kultur so nato analizirali koncentracijo TNF α. Sintezo slednje bi prisotnost IL-37b morala znižati.  
+
Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP <ref> TSP: ''Total soluble protein'' - celokupna količina topnih proteinov </ref>. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).
-
Tako matIL-37b kot tudi pro-IL37b sta biološko aktivna, zrela oblika toliko bolj zaradi neprisotnosti nativnega signalnega peptida – konformacijsko ugodnejša oblika pripomore k boljši vezavi na receptor.
+
 
-
<h2>Pomen študije</h2>
+
Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.
 +
<h2>Rezultati in zaključek</h2>
 +
Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, v katerem se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina.
 +
Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida <ref name="prvi"/>.
 +
Kot novoodkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name="prvi"/>. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil <ref name="tretji">[https://dx.doi.org/10.12688%2Ff1000research.8010.1 Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.]</ref>.
 +
 
 +
 
 +
<h2>Viri</h2>
 +
<references/>

Current revision

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako prooblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije provnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva[1] [2]. V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic[1].

Contents

Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum

Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.

  • Prekurzorska oblika: proIL-37b, celotna dolžina

pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.

  • Zrela oblika: matIL-37b, brez nativnega signalnega peptida

Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.

  • Fuzijski protein: SBA-IL-37b, fuzija z aglutininom iz soje

Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens. Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo. Z vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo [1].

Karakterizacija produktov

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP [3]. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.

Rezultati in zaključek

Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, v katerem se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina. Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida [1]. Kot novoodkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa možnost platforme za proizvodnjo. Za razliko od bakterijskih kultur so neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini, kompleksne evkariontske post-translacijske modifikacije so omogočene. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g [1]. Rastline tako predstavljajo cenovno in energijsko ugodnejše možnosti proizvodnje bioloških zdravil [4].


Viri

  1. 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019
  2. L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.
  3. TSP: Total soluble protein - celokupna količina topnih proteinov
  4. Q. Chen and K. R. Davis, “The potential of plants as a system for the development and production of human biologics,” F1000Research, vol. 5, p. F1000 Faculty Rev-912, May 2016.
Personal tools