Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
Line 1: Line 1:
Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva
Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva
-
Prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα), v študijah na transgenih miših je to vodilo v »profilakso« pred srčno ishemijo ali ishemičnimi poškodbami jeter. Dodatek IL-37 mišim prepreči psoriazo, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.
+
V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic.  
-
 
+
Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.
-
Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37 predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni.
+
-
Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije s sesalskimi patogeni / bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.
+
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>

Revision as of 18:16, 11 March 2019

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic. Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g.

Contents

Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum

Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.

  • Prekurzorska oblika: proIL-37b, celotna dolžina

pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.

  • Zrela oblika: matIL-37b, brez nativnega signalnega peptida

Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.

  • Fuzijski protein: SBA-IL-37b, fuzija z aglutininom iz soje

Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »triparental mating«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »agrobacterium-mediated leaf disc method«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo.

Karakterizacija produktov

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.

Rezultati in zaključek

Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina. Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida. Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa ugodnejšo možnost platforme za proizvodnjo.

Personal tools