Proizvodnja funkcionalnega človeškega IL37 v rastlinah

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
Line 3: Line 3:
Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name = "prvi"/>.
Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g <ref name = "prvi"/>.
-
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum</h2>
+
<h2>Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v ''Nicotiana tabacum''</h2>
<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>
<h3>Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija</h3>

Revision as of 18:36, 11 March 2019

Interlevkin 37 je citokin družine IL-1. Znanih je 5 izooblik (najpogostejša IL-37b), mišjih homologov ni, vendar humani IL-37 deluje tudi na mišjih celicah. Sintetizira se kot prekurzor, procesira ga kaspaza-1 (odcepi N-končni signalni peptid). Biološko aktivni sta tako pro-oblika kot tudi zrela oblika. Veže se na receptor IL-18Rα ali se prenese v jedro, oboje vodi v utišanje transkripcije pro-vnetnih signalnih molekul in omejevanje vnetij prirojenega/adaptivnega imunskega odziva[1] [2]. V študijah na transgenih miših prekomerno izražanje IL-37 v epitelnih celicah / makrofagih utiša izražanje pro-vnetnih citokinov (IL-1α, IL-1β, TNFα). Že dodatek rekombinantnega IL-37 mišim prepreči luskavico, revmatoidni artritis in arterosklerozo, prav tako naj bi inhibiral rast rakavih celic. Transgene rastline so za razliko od bakterijskih kultur neomejene v smislu obsega proizvodnje, cena je nižja, ni kontaminacije z bakterijskimi endotoksini. Kot evkarionti so zmožne tudi kompleksnih post-translacijskih modifikacij. Količina prehodno izraženega proteina lahko v nekaj tednih doseže nivo 1 g [1].

Contents

Proizvodnja in karakterizacija človeškega IL-37b v Nicotiana tabacum

Oblikovanje konstruktov in agroinfiltracija

V nizko-alkaloidni vrsti tobaka (Nicotiana tabacum) so izrazili tri različne konstrukte IL-37b, zapis so pridobili iz klona cDNA človeškega IL-37b.

  • Prekurzorska oblika: proIL-37b, celotna dolžina

pBI-proIL-37b nosi zapis za pro-IL37b in je nastal s kloniranjem zapisa za pro-obliko v binarni rastlinski vektor pBI101.1. Ker (funkcionalnega) homologa živalski kaspazi-1 v rastlinah ni, se je proizvedla izključno pro-oblika proteina, lokalizirana v citoplazmi.

  • Zrela oblika: matIL-37b, brez nativnega signalnega peptida

Vektorja pBI-sp(amy)-IL37b in pBI-sp(pr1b)-IL37b nosita zapis za zrelo obliko IL-37 brez N-končnega signalnega peptida. Slednjega so zamenjali z endogenim signalnim peptidom α-amilaze iz hmelja oz. s proteinom PR1b iz tobaka. Na C-koncu dodali ER-retencijski signal KDEL, ki poveča izražanje s selektivnim usmerjanjem v ER.

  • Fuzijski protein: SBA-IL-37b, fuzija z aglutininom iz soje

Vektor pBI-SBA-IL37b nosi zapis za fuzijski protein IL-37b z aglutininom iz soje (SBA). Odstranili so N-končni endogeni signalni peptid, C-konec modificirali s KDEL, dodali zaporedje za SBA. Za slednje je znano, da poveča izražanje heterolognih proteinov in poenostavi čiščenje produkta.

Vektorje so namnožili in oblikovali v E. coli ter jih nato prenesli v A. tumefaciens (t.i. »triparental mating«). Tobak so preko poškodb na listih transformirali z agroinfiltracijo (t.i. »agrobacterium-mediated leaf disc method«). S vsakim konstruktom so transformirali 25 rastlin, morfoloških razlik med slednjimi in ne-trasformirano kontrolo ni bilo [1].

Karakterizacija produktov

Pri vzorcih s pro-IL37b je prenos Western pokazal močni lisi pri 50kDa (dimerna oblika) in 25kDa (monomerna oblika). Količina izraženega proteina je dosegla 1% TSP. Pri maIL-37b je najmočnejša lisa ustrezala velikosti monomera (20kDa), izraženega proteina je bilo manj v primerjavi s pro-obliko (0,01% TSP). Pri fuzijski obliki SBA-IL37b so prevladovale lise pri 50kDa (monomer) in nad 75kDa (dimer, trimer, tetramer), nivo izražanja je dosegel 1% TSP. Restrikcija s proteazo TEV je fuzijsko obliko pričakovano in popolnoma razgradila na dve komponenti (SBA in IL-37b).

Biološko aktivnost so testirali na mišjem epitelu ledvičnih tubulov. Z ELISO so pokazali inhibicijo sinteze pro-vnetnega citokina TNFα (posledica stimulacije LPS), saj z večanjem koncentracije IL-37b količina slednjega v supernatantu celic pada.

Rezultati in zaključek

Različne količine pridobljenih produktov nakazujejo na pomen post-translacijske lokalizacije proteinov in tudi samega razvoja konstruktov. Pro-oblika je ostala v citoplazmi: rastlinska celica verjetno ne prepozna nativnega signalnega peptida, citoplazma pa za razliko od ER, kjer se je lokalizirala zrela oblika, predstavlja ugodnejše mesto za protein. IL-37b je znan kot nestabilni protein (prisotnost funkcionalnih elementov mRNA za »nestabilnost«), delno naj bi na stabilnost vplival nativni signalni peptid, sicer pa so izplen zrele oblike povečali s fuzijo SBA. Za slednjo je značilna visoka stopnja stabilnosti, kar poveča nivo izraženega fuzijskega proteina. Pokazali so, da sta pro- in zrela oblika biološko aktivni, prvo naj bi pri vezavi na receptor omejevala konformacija, ki je posledica nativnega signalnega peptida [1]. Kot novo-odkriti protivnetni citokin, IL-37b predstavlja primerno tarčo za zdravljenje vnetnih in avtoimunih bolezni, transgene rastline pa ugodnejšo možnost platforme za proizvodnjo.

Viri

  1. 1.0 1.1 1.2 1.3 N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma, “Production of functional human interleukin 37 using plants.,” Plant Cell Rep., vol. 38, no. 3, pp. 391–401, Mar. 2019
  2. L. Wang, Y. Quan, Y. Yue, X. Heng, and F. Che, “Interleukin-37: A crucial cytokine with multiple roles in disease and potentially clinical therapy.,” Oncol. Lett., vol. 15, no. 4, pp. 4711–4719, Apr. 2018.
Personal tools