Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
Line 8: Line 8:
== Transgenske živali ==
== Transgenske živali ==
-
V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).
+
V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši, od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).
== Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini ==
== Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini ==
Line 14: Line 14:
== Linija 553 transgenskih miši ==
== Linija 553 transgenskih miši ==
-
Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz jeter, mišic … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina.  
+
Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz mišičnega tkiva, jetrnega tkiva … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina.  
== Zaključek ==
== Zaključek ==
S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj je nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.
S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj je nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.

Revision as of 19:23, 27 March 2017

Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Običajno se uporablja izražanje proteinov v mleku, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina. Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov. V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. human nerve growth factor (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevronskih bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevronske. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Ta je tudi bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.

Contents

Priprava plazmida

Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen hNGF, vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (bGH-pA), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in EGFP, ki sta povezana preko 2A peptida (Neo-2A-EGFP).

Transgenske živali

V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši, od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).

Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini

Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je bila raven proteina bolj variabilna kot pri prisotnosti le ene kopije. Določili so tudi koncentracijo mNGF, ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši.

Linija 553 transgenskih miši

Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz mišičnega tkiva, jetrnega tkiva … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina.

Zaključek

S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj je nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.

Personal tools