Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Contents

UVOD

Eden izmed načinov obrambe bakterije pred bakteriofagi je proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev. Tako deluje npr. mikrocin J25, katerega primarna naloga je, da zavira rast drugih sevov bakterije iste vrste. Dokazano je bilo, da se tako kot fag T5 veže na membranski receptor FhuA, ki je sicer zadolžen za prenos Fe3+ ionov v bakterijo. Mikrocin J25 z vezavo na receptor FhuA prepreči vezavo faga T5 in vnos DNK faga v E. Coli.

MOLEKULARNE KOMPONENTNE INFEKCIJE E.COLI S STRANI FAGA T5 IN ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE

STRUKTURA MEMBRANSKEGA RECEPTORJA FhuA

FhuA je protein z maso 78.9 kDa, ki se nahaja v zunanji membrani gram-negativnih bakterij kot je E.coli (sev K-12). Njegova primarna funkcija je transport Fe+3 ionov v celico. Receptor FhuA tvorita sodčkasta domena iz 22 antiparalelnih β-trakov, ki so vgrajeni v membrano in N-končna globularna domena, ki se zloži v notranjost sodčka ter zakrije večinski del notranjosti le-tega. N-končna globularna domena je sestavljena iz 4-verižne β-plošče in iz 4 kratkih vijačnic. Globularna domena je vezana tako na sodčkasto domeno kot tudi na hidrofilne zanke usmerjene v zunanji mediju ter je odgovorna za vezavo liganda; hidroksamatnega siderofora – ferikroma, ki veže Fe3+ ione. Razen svoje primarne funkcije, je FhuA tudi receptor za različne fage; T1,T5 in ɸ80 ter za antibiotik albomicin.

STRUKTURA FAGA T5

Struktura faga T5je bila določena z uporabo krio-elektronske mikroskopije. Fag T5 uvrščamo v družino fagov Siphoviridae, za predstavnike katere je značilno, da imajo ikozaedrično oblikovano kapsido; ta vsebuje močno zvito, zgoščeno dvojno verižno DNA in rep. Rep predstavlja multiproteinski skupek, ki služi za prepoznavanje površine bakterijskih celic in za prenos genoma v to gostiteljsko celico. Za to družino fagov je značilno, da v strukturi vsebujejo dolg in nekrčljiv rep.Fag T5 ima 250 nm dolg rep, ki se konča s tremi L-oblikovanimi fibrilarnimi strukturami, ki so pritrjene na stožčasto podlago in premočrtno centralno fibrilo.

ZAČETNI MEHANIZEM INFEKCIJE IN INTERAKCIJA MED pb5 in FhuA

Specifičnost gostiteljske celice pri procesu okužbe s strani fagov družine Siphoviridae je določena z interakcijo med receptor vezavnim proteinom in specifičnim receptorjem na površini bakterijske celice. Prepoznavanje lahko poteka preko interakcij s saharidnimi ali proteinskimi komponentami receptorja. Ti receptor vezavni proteini se nahajajo na konici centralne fibrile v repu. To interakcijo pogosto zaznamuje dvostopenjski proces; v prvi fazi se fag reverzibilno adsorbira na receptorje z nizko vezavno afiniteto, kasneje pa se ireverzibilno veže na sekundarna mesta v receptorju. Interakcija receptor vezavni protein-receptor sproži konformacijske spremembe v strukturi repa, kar povzroči, da se kapsida odpre, pri tem se razpre zunanja membrana bakterije. Ob tem se DNK faga prenese preko repa skozi bakterijsko ovojnico v notranjost celice. Proces prepoznavanja v primeru faga T5 se prične z reverzibilno vezavo L-oblikovane proteinske niti na O-antigen lipopolisaharidne komponente. Nato se fag ireverzibilno veže na zunanji del ferikromskega transporterja FhuA z receptor vezavnim proteinom pb5.

Različne raziskave in vivo ter in vitro predpostavljajo naslednji mehanizem infekcije : v prvi stopnji se fag T5 reverzibilno veže s proteinom pb1 (ta sestavlja del L-oblikovane fibrile) na polimanozni O-antigen in pospeši hitrost vezave pb5 na FhuA. Nato se protein pb2 (del centralne fibrile) veže na površino bakterije. Ta interakcija ne vključuje sodelovanja specifičnih membranskih receptorjev. Centralna premočrtna fibrila se nato usidra v bakterijsko zunanjo membrano, dokler pb5 ne interagira s FhuA. Ta interakcija povzroči sprostitev DNK iz kapside. DNK se nato prenese v notranjost celice preko kanalčka, ki nastane iz proteina pb2. Kanalček sega od zunanje membrane, periplazme do citoplazemske membrane. Tak kanalček zaščiti DNK pred delovanjem periplazemskih nukleaz.

MIKROCINI

Bakterije morajo znotraj svoje niše med seboj tekmovati za vire hranil in prostor. Izdelava “orožja” proti drugim bakterijam je torej zelo pomembna za njihovo preživetje. Ena izmed zelo razširjenih taktik tekmovanja med bakterijami je tvorba bakteriocinov. To so antimikrobni peptidi, ki delujejo kot toksini, saj zavirajo rast podobnih oziroma filogenetsko sorodnih bakterijskih sevov (tako na primer, E. coli izloča mikrocine, ki napadajo le seve E. coli). Sintetizirajo se, ko v okolju primanjkuje hranil in bakterije stradajo. Mikrocini so bakteriocini s kratkim aminokislinskim zaporedjem. Izločajo jih enterobakterije, to so Gram-negativni bacili, ki so v naravi zelo razširjeni, prav tako pa so del črevesne flore (kar pove že ime). Njihov zapis se nahaja na plazmidih. Mikrocine delimo v dva razreda:

  • razred I – po translaciji pride do obširnih posttranslacijskih modifikacij, vsebujejo disulfidne mostičke
  • razred II – ne prihaja do posttranslacijskih modifikacij

STRUKTURA MIKROCINA J25

V prvi razred mikrocinov sodi tudi mikrocin J25 (MccJ25). Sestavljen je iz 21 aminokislinskih ostankov, odlikuje pa ga zanimivo zvitje, ki je sicer med peptidi zelo redko. Sprva je veljalo mnenje, da ima v celoti ciklično strukturo, nedavne raziskave pa so pokazale, da se po translaciji zvije v strukturo, ki spominja na laso. N-konec peptida je v obliki makrolaktamskega obroča, ki ga tvorita aminokislinska ostanka Gly1 in Glu8, pri čemer aminska skupina iz glicina tvori peptidno vez s karboksilno skupino stranske skupine glutamata. Peptid se nato nadaljuje v β-lasnično zanko (dva antiparalelna β-trakova povezana z zanko, ki jo tvorita Val11 in Pro16), ki jo tvorijo aminokislinski ostanki 9-18. C-konec mikrocina (t.i. rep) prehaja skozi obroč, kar je sicer entropijsko zelo neugodno, zato je tako zvitje med peptidi zelo redko. V primeru J25 pa je taka struktura celo zelo stabilna – dva aminokislinska ostanka z aromatskimi stranskimi skupinami, Phe19 in Tyr20, vsak iz ene strani “sidrata” C-konec v makrolaktamski obroč. Ker sta stranski skupini teh ostankov tako veliki, prihaja do steričnega oviranja z obročem, zato rep ne more "pobegniti". Sterična stabilizacija je tako močna, da je J25 odporen celo proti večini proteaz in visokim temperaturam. V močno kislem mediju in ob delovanju endopeptidaz se cepi le β-lasnična zanka, ne pa tudi obroč (rep ostane ujet).

DELOVANJE MIKROCINA J25

Mikrocin J25 je toksičen le za rod Salmonella in seve vrste E. coli. Rast celic zavre tako, da preide v celico, kje deluje kot inhibitor RNA-polimeraze. Za inhibicijo je pomemben makrolaktamski obroč, ki kot čep zamaši kanal v polimerazi, ki usmerja ustrezne ribonukleozid trifosfate na aktivno mesto.Za prehod skozi celični membrani Gram-negativnih bakterij J25 izkorišča receptor za železo v zunanji membrani; FhuA in z njim sklopljen kompleks TonB–ExbB–ExbD (na receptorju pravzaprav parazitira). To so pokazali številni eksperimenti, pri katerih so v E. coli z delecijo gena za FhuA vnesli plazmid z zapisom za FhuA iz E. coli ali rodu Salmonella. Bakterije brez receptorja so bile odporne na mikrocin J25, po vnosu plazmida pa so nanj postale občutljive.

Ker je železo slabo topno, prehaja skozi receptor v obliki ferikroma, ki po obliki niti malo ne spominja na mikrocin J25, zatorej vezava mikrocina na receptor ni samoumevna. Kako se torej mikrocin veže na FhuA? Primerjava kristalnih struktur kompleksov FhuA-ferikrom in FhuA-J25 je pokazala, da se oba liganda v receptor vežeta na podobnem mestu. Pri tem ferikrom tvori veliko vodikovih vezi z N-globularno domeno FhuA, ki deluje kot zamašek, MccJ25 pa s to domeno tvori le dve vodikovi vezi. Ta podatek nakazuje na to, da za vezavo na receptor FhuA ni potrebna dobra ohranjenost liganda, kar razloži tudi vezavo MccJ25, čeprav je le-ta po strukturi zelo različen od primarnega liganda.

Opravljene so bile tudi številne raziskave, ki so identificirale ostanke na MccJ25, ki so pomembni za vezavo na receptor. Že sama poravnava strukture nevezanega mikrocina (struktura pridobljena z NMR), s strukturo na receptor vezanega mikrocina (struktura, pridobljena z rentgensko kristalografijo) je pokazala, da pride ob vezavi mikrocina do obširne konformacijske spremembe v predelu β-lasnične zanke, medtem ko ostane struktura laktamskega obroča nespremenjena. Iz tega so sklepali, da je za vezavo najpomembnejša lasnična regija. Raziskava, ki je to potrdila, je temeljila na razgradnji te zanke s termolizinom (cepitev vezi med Val11 in Phe16). Izvedena je bila serija poskusov z bakteriofagom T5, ti pa so opisani v nadaljevanju.

POSKUSI O VPLIVIH VEZAVE MIKROCINA J25 NA RECEPTOR FhuA NA VEZAVO FAGA T5

S serijo poskusov z bakteriofagom T5 in mikrocinom MccJ25 (oz. t-MccJ25) so v raziskavi želeli pokazati kako vezava MccJ25 na receptor FhuA vpliva na vezavo faga. V prvem poskusu so raziskovalci preverjali inhibicijo bakterijske infekcije s fagom T5 v prisotnosti mikrocina. Suspenzijo E. Coli (sev W3110) v eksponentni fazi rasti so prenesli v LB (lysogeny broth) medij. Bakterijam so dodali raztopino MccJ25 ali t-MccJ25 v metanolu in jih nato inkubirali na sobni temperaturi. Dodali so fag T5 in po stresanju in inkubaciji pri 37°C 120 minut z merjenjem absorbance pri 620 nm nadzorovali stopnjo lize bakterij. Izvedena sta bila dva kontrolna poskusa in sicer v prisotnosti faga T5 brez mikrocina in pa z mikrocinom brez faga (kontrola rasti).

Rezultati kontrole rasti so pokazali, da MccJ25 in t-MccJ25 v koncentracijah do 10μM sama bistveno ne vplivata na rast bakterij. V odsotnosti MccJ25 je liza bakterij nastopila 50 minut po dodatki faga T5. Dodatek MccJ25 je lizo inhibiral, učinek pa je bil odvisen od koncentracije dodanega mikrocina. Hitrost rasti bakterij je dosegla svojo prvotno vrednost (vrednost brez dodanega faga) ob dodatku 10 μM raztopine mikrocina. t-MccJ25 ni inhibiral lize bakterij.

Da bi preverili, če do inhibicije lize pride zaradi kompetitivne adsorpcije mikrocina na bakterijo, so pri drugem poskusu opazovali vpliv mikrocina na adsorpcijo faga T5 na E. Coli. Ponovno so raztopino bakterij v eksponentni fazi rasti prenesli v LB medij in jih inkubirali pri sobi temperaturi z MccJ25 oz. s t-MccJ25. Za kontrolni poskus so raztopini bakterij dodali le topilo brez mikrocina (50 % acetonitril). Po prvi inkubaciji so dodali fag T5 in inkubirali še 15 minut. S centrifugiranjem so nato odstranili adsorbirane fage ter določili število neadsorbiranih virusov. Delež adsorbiranih fagov se je zmanjšal iz 80 % pri 0,1 μM koncentraciji na 15 % pri 5 μM koncentraciji MccJ25. t-MccJ25 ni imel vpliva na adsorpcijo faga.

Raziskovalci so želeli dokazati, da je v prisotnosti mikrocina MccJ25 res inhibirana vezava na receptor FhuA. V pufru so 10 minut inkubirali FhuA in mikrocin (MccJ25 (50 nM-3,1 μM) oz. t-MccJ25 (3,1 μM)), prisoten pa je bil še fluorescentni marker za DNA. Po inkubaciji so v vsak vzorec dodali fag T5 in opazovali injekcijo DNA v raztopino. Že v prejšnjih raziskavah je bilo dokazano, da bakteriofag ob vezavi na FhuA receptor injicira DNA v raztopino, zaradi česar lahko ob prisotnosti fluorescentnega markerja merimo fluorescenco. Rezultati so pokazali, da se z višanjem koncentracije mikrocina MccJ25 fluorescenca manjša. Izračunano je bilo 55 % zmanjšanje adsorpcije faga (iz 100 % na 45 %) pri višanju koncentracije iz 0,1-3,1 μM mikrocina. t-MccJ25 ponovno ni imel učinka na injekcijo DNA faga.

Iz vseh eksperimentov lahko sklepamo, da je mikrocin MccJ25 res kompetitivni inhibitor vezave bakteriofaga T5 na receptor FhuA. Prav tako je razvidno, da cepitev zanke s termolizinom v strukturi t-MccJ25 bistveno vpliva na interakcijo s FhuA receptorjem.

VIRI IN LITERATURA

  • Rebuffat, S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria, Biochemical Society Transactions, 2012, Vol. 40, part 6 str. 1456 -1462
  • Mathavan, I., Zirah, S., Mehmood, S., Choudhury, H. G., Goulard, C., Li, Y.,Beis, K.,Structural basis for hijacking siderophore receptors by antimicrobial lasso peptides. Nature chemical biology,2014, Vol 10 issue 5, 340–342. doi:10.1038/nchembio.1499
  • Volkmar Braun, FhuA (TonA), the Career of a Protein, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, June 2009, p. 3431–3436 Vol. 191, No. 11 0021-9193/09/$08.00_0 doi:10.1128/JB.00106-09
  • Flayhan, Ali; Wien, Frank; Paternostre, Maïté; Boulanger, Pasc , New insights into pb5, the receptor binding protein of bacteriophage T5

and its interaction with its Escherichia coli receptor FhuA, Biochimie Vol. 94 issue 9 2012 , doi :10.1016_j.biochi.2012.05.021

  • Destoumieux-Garzón, Delphine; Duquesne, Sophie; Peduzzi, Jean, The iron–siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11–Pro16 β-hairpin region in the recognition mechanism, Biochemical Journal, Vol. 389 issue 3 2005, doi: 10.1042_bj20042107
  • Robin Leatherbarrow, R H Templer, Biophisical chemistry: Membranes and Proteines,Royal Society of Chemistry, 2007, ISBN 1847550258, str.215-219
  • Pascale Boulanger, Insights into Bacteriophage T5 Structure from Analysis of Its Morphogenesis Genes and Protein Components, Journal of Virology Dec 2013, Vol.88, issue 2 1162-1174; doi: 10.1128/JVI.02262-13
Personal tools