View source for Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja

Izhodiščni članek: S. ping Han et al., “Programmable siRNA pro-drugs that activate RNAi activity in response to specific cellular RNA biomarkers,” Mol. Ther. - Nucleic Acids, vol. 27, no. March, pp. 797–809, 2022, doi: 10.1016/j.omtn.2021.12.039.

== Uvod ==

Načrtovanje novih zdravilnih učinkovin je usmerjeno v tarčne molekule, ki so ključne za razvoj in napredovanje določene bolezni. Največji problem pri načrtovanju teh pa je, da imajo lahko iste tarčne molekule ključno funkcijo tudi v zdravih celicah. Takšna učinkovina sicer tarčno molekulo uspešno inaktivira, vendar hkrati povzroči škodo tudi v zdravih celicah (ang. off-target effects). Že odkar je Paul Ehrlich leta 1908 predstavil koncept »magic bullet«, se raziskovalci usmerjajo v načine tarčnega delovanja zdravil samo na obolele celice oziroma celice povezane z razvojem določne bolezni, učinek na zdrave celice in tkiva pa bi bil minimalen. 

Eden od načinov za tarčno dostavo zdravil v tarčne celice je konjugacija s protitelesi ali v kompleksih z nanodelci. Vendar pa takšen način dostave ni vedno izvedljiv, saj večina obolelih celice ne izraža specifičnih površinskih biomarkerjev, ki bi omogočili prepoznavanje in učinkovito dostavo zdravila v celico. Drug način so zdravila, ki so dostavljena v proobliki in se aktivirajo šele po encimskem procesiranju v tarčnem tkivu, s čimer lahko močno izboljšamo tkivno selektivnost, vendar še vedno ostajajo omejitve. V nasprotju pa si lahko zagotovimo visoko stopnjo selektivnosti, če uporabimo učinkovine, ki direktno interagirajo s procesi izražanja in regulacije genov, povezanih z določeno boleznijo. Pri dostavi takšnih zdravil pa moramo največkrat uporabiti velike DNA-vektorje ali molekule mRNA, konstrukti lahko trajno spremenijo celično DNA in zahtevajo kompleksne razvojne in proizvodnje postopke v primerjavi z molekularnimi zdravili, kar je tudi finančno gledano potratno. 

Kot dobra rešitev se je izkazala uporaba majhne interferenčne RNA (siRNA) [1], ki ima v primerjavi s prej naštetimi možnostmi kar nekaj prednosti:
* z uporabo siRNA lahko preko aktivacije procesa interferenčne RNA (RNAi) utišamo specifičen transkript RNA
* siRNA je mnogo manjši konstrukt od večine DNA-vektorjev, uporabljenih pri genskih terapijah
* omogoča začasno delovanje, brez spreminjanja genoma gostitelja
* proizvodnja siRNA je efektivna in poceni (kemijska sinteza)
* s kemijsko sintezo lahko v konstrukt vstavimo kemične modifikacije, ki nam omogočijo bolj učinkovito dostavo siRNA v celice in povečajo stabilnost konstrukta

Sledili so poskusi izboljšanja tarčnega delovanja zdravil na osnovi siRNA tako, da bi ta delovala kot nekakšna »ribostikala«, ki bi sprostila aktivno molekulo siRNA samo v primeru, da »ribostikalo« interagira s specifičnim biomarkerjem v celici [2]. Zdravilo bi se torej nahajalo v proobliki, ki bi se aktiviralo na podlagi specifičnega transkripta v celici ter obdržalo aktivnost siRNA, ki bi lahko aktiviralo proces RNAi. Prvi poskusi tašnih »ribostikalnih« siRNA niso dovolj dobro zavrle RNAI v netarčnih celicah in dovolj učinkovito delovale v tarčnih celicah, poleg tega procesi niso bili optimizirani za načrtovanje konstruktov s katero koli željeno kombinacijo tarčne molekule in biomarkerja. 
V tej raziskavi so predstavili protokol za načrtovanje t.i. pogojno aktivirane siRNA (Cond-siRNA; ang. conditionally activated siRNA), ki se lahko aktivira le ob prisotnosti RNA-biomarkerja (mRNA), specifičnega za določeno bolezensko stanje [3].

== Rezultati ==
=== Načrtovanje Cond-siRNA ===
Konstrukt Cond-siRNA je sestavljen iz treh verig RNA – iz senzorične, vodilne in notranje verige, ki predstavlja neke vrste ogrodje konstrukta. Senzorična veriga je komplementarna molekuli mRNA specifičnega biomarkerja in je ključna za tarčno aktivacijo mehanizma RNAi v točno določenem tipu celic. Vodilna veriga pa je komplementarna molekuli mRNA, katere izražanje želimo utišati. Vse tri verige se med seboj povežejo in se sestavijo v dva RNA-dupleksa, ki sta preko povezav na koncih povezana v rigidno paralelno konfiguracijo. 
Konstrukt obstaja v dveh možnih stanjih – v neaktivnem stanju OFF in aktivnem stanju ON. V neaktivnem stanju OFF senzorični dupleks onemogoča vezavo encimov, ključnih za aktivacijo RNAi v celici.  Senzorični dupleks in točno določne kemijske modifikacije na konstruktu namreč zakrivajo cepitveno mesto za encim Dicer, ki se zaradi steričnih ovir ne more vezati in s tem procesirati dvoverižne siRNA. Če pa se konstrukt nahaja v celicah, ki izražajo za bolezen specifičen biomarker, pa se RNA-biomarker preko komplementarnih baznih parov poveže s senzorično verigo in poruši strukturo senzoričnega heliksa. Zaradi tega pride do sprostitve dupleksa siRNA in preklopa v aktivno konformacijsko stanje ON. Previsne konce na siRNA razgradijo endogene nukleaze, izpostavi se vezavno mesto za Dicer, ki cepi dvoverižno molekulo RNA. V celici se sestavi kompleks RISC, ki razgradi tarčno molekulo mRNA in tako utiša izražanje tarčnega proteina. 

Sesalske celice imajo kompleksne poti regulacije in degradacije molekul RNA. Na točno določena mesta v konstruktu so zato uvedli različne kemijske modifikacije: fosforotioatno ogrodje (PS; ang. phosphorothioate backbone linkages), 2'-O-metilacijo baz (2'OMe) in »zaklenjene« (LNA; ang. locked nucleic acid) oziroma »mostovne« nukleinske kisline (BNA; ang. bridged nucleic acid), ki so povečale termodinamsko stabilnost konstrukta in ga zaščitile pred neželjeno ribonukleazno aktivnostjo oziroma razgradnjo.

=== 3D-struktura konstruktov Cond-siRNA ===
Za napoved 3-dimenzionalne strukture dveh konstruktov Cond-siRNA z različnimi kombinacijami kemijskih modifikacij so uporabili metodo molekulske dinamike (MD). S simulacijo so pokazali, da se oba dupleksa sestavita, tako kot so predpostavili – cepitveno mesto za Dicer je bilo orientirano v notranjost strukture. Simulacija MD pa je podala ključno informacijo o nadaljnem načrtovanju senzorične verige – odvijanje senzoričnega dupleksa naleti na manj steričnih ovir, če se molekula mRNA biomarkerja najprej veže na 3'-konec senzorične verige.

=== Funkcionalnost konstrukta Cond-siRNA ===
Naslednja stopnja je bilo testiranje konstruktov na sesalskih celičnih linijah s specifičnimi kombinacijami biomarkerjev in tarčnih molekul in različnimi kombinacijami kemijskih modifikacij na različnih delih konstrukta. Eksperiment so izvedli na celični liniji HCT116. Celice so najprej transficirali z dvema različnima DNA-plazmidoma:
* PsiCheck-2 dual-luciferase reporter (Promega), ki je imel na 3'-koncu zapisa za luciferazo zapis za tarčno molekulo 
* pBlueScript, ki je nosil različne zapise biomarkerskih molekul pod kontrolo promotorja polimeraze III
Po 8 urah so izvedli še transfekcijo s konstruktom Cond-siRNA in po 48 urah analizirali izražanje luciferaze. 

Ugotovili so, da konstrukt učinkovito zmanjša ekspresijo luciferaze oziroma utiša tarčni protein v primeru, ko celica izraža pravilni biomarker, medtem ko v celicah, ki so izražale napačen biomarker, do utišanja ni prišlo. Poleg tega je bilo utišanje sorazmerno s koncentracijo transficiranega konstrukta Cond-siRNA. Pri konstruktih, ki so vsebovali neidealne kemijske modifikacije, so opazili, da je utišanje neodvisno od prisotnosti pravilnega biomarkerja, kar nakazuje na vpliv pravilnih kemijskih modifikacij na senzorično aktivnosti konstrukta. Konstrukti, ki so imeli podaljške na 3'-koncu senzorične verige, so izkazovali boljšo aktivnost RNAi, kar je potrdilo predpostavke, podane na podlagi simulacij MD.

=== Uporaba Cond-siRNA na ''in vitro'' modelu hipertrofije srčne mišice ===
Da bi preverili, ali Cond-siRNA pravilno deluje tudi v realnih bioloških oziroma patoloških stanjih, so v podganji kardiomiocitni celični liniji (H9C2) testirali Cond-siRNA, ki zaznava prisotnost biomarkerja APN oziroma mRNA gena NPPA (ang. natriuretic peptide A) in utiša izražanje kalcinevrina (PPP3CA; protein fosfataza 3 katalitična podenota alfa), ključnega regulatorja hipertrofije. Celice H9C2, izpostavljene fenilefrinu, predstavljajo uveljavljen in vitro model hiperftrofije srčne mišice, ki izražajo biomarker APN (ang. atrial natriuretic peptide), razvoj hipertrofije pa je povezan s povišano koncentracijo PPP3CA [4]. 

Celice H9C2 so izpostavili 50 µl fenilefrina in jih transficirali z ANP-kalcinevrin Cond-siRNA, torej s konstruktom, ki je imel senzorično verigo komplementarno mRNA za APN in vodilno verigo komplementarno mRNA za PPP3CA oziroma proti katalitični podenoti alfa kalcinevrina. Dokazali so, da prisotnost Cond-siRNA zmanjša izražanje PPP3CA samo v celicah, ki izražajo NPPA, utišanje pa je bilo sorazmerno s koncentracijo prisotne Cond-siRNA. Učinek utišanja PPP3CA je bil primerljiv s komercialno dostopnimi siRNA proti PPP3CA. Podobnega učinka pa ni bilo moč opaziti v kontrolnih celicah, ki NPPA niso izražale, s čimer so dokazali, da se konstrukt Cond-siRNA aktivira le ob prisotnosti točno določenega biomarkerja oziroma v točno določenih in vnaprej načrtovanih celicah, v drugih pa ne. 

== Zaključek ==
V raziskavi je predstavljena strategija za razvoj konstruktov Cond-siRNA, ki se aktivirajo le ob prisotnosti specifičnih biomarkerjev bolezenskih stanj. Prozdravila na osnovi Cond-siRNA lahko torej sama regulirajo aktivnost RNAi v sesalskih celicah na osnovi RNA-biomarkerjev, ki jih transficirana celica izraža. Cond-siRNA ima za razliko od konvencionalnih siRNA nizko stopnjo aktivacije v netarčnih celicah in aktivnost, primerljivo s konvencionalnimi siRNA, v tarčnih celicah. Senzorična veriga je popolnoma neodvisna od zaporedja vodilne verige oziroma siRNA, kar nam omogoča, da lahko z isto siRNA utišamo gene samo v določenem tipu celic ali pa v celicah, ki izražajo enak biomarker, utišamo kateri koli gen. Poleg tega lahko stabilnost in dostopnost zdravila reguliramo z različnimi kemijskimi modifikacijami konstrukta. Konstrukt Cond-siRNA se je torej izkazal kot perspektivna možnost za tarčno zdravljenje, vendar je v nadaljevanju potrebno učinkovitost konstrukta preveriti tudi na živalskih modelih in vivo.

== Viri in literatura ==

[1]	R. L. Setten, J. J. Rossi in S. ping Han, “The current state and future directions of RNAi-based therapeutics,” Nat. Rev. Drug Discov., vol. 18, no. 6, pp. 421–446, 2019, doi: 10.1038/s41573-019-0017-4.

[2]	E. Bindewald, K. A. Afonin, M. Viard, P. Zakrevsky, T. Kim in B. A. Shapiro, “Multistrand Structure Prediction of Nucleic Acid Assemblies and Design of RNA Switches,” Nano Lett., vol. 16, no. 3, pp. 1726–1735, 2016, doi: 10.1021/acs.nanolett.5b04651.

[3]	S. ping Han et al., “Programmable siRNA pro-drugs that activate RNAi activity in response to specific cellular RNA biomarkers,” Mol. Ther. - Nucleic Acids, vol. 27, no. March, pp. 797–809, 2022, doi: 10.1016/j.omtn.2021.12.039.

[4]	P. Banerjee and A. Bandyopadhyay, “Cytosolic dynamics of annexin a6 trigger feedback regulation of hypertrophy via atrial natriuretic peptide in cardiomyocytes,” J. Biol. Chem., vol. 289, no. 9, pp. 5371–5385, 2014, doi: 10.1074/jbc.M113.514810.