RNA-stikala tipa »Toehold«: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
(New page: <h2>Predhodni riboregulatorji</h2> Uporaba regulatornih zaporedij RNA razreši ozko grlo, ki sicer pesti sintezno-biološke pristope k napovedovanju in nadzoru obnašanja bioloških sistem...)
Line 3: Line 3:
Slednje sestavljata dve molekuli RNA: pretvornik, ki regulira proces ter trans-aktivna RNA, sprožilec, ki modulira delovanje pretvornika. Razvrščamo jih glede na tip začetnih interakcij med molekulama RNA: hibridizacija zaporedij med zankama (loop-loop interactions) ter hibridizacija zaporedij med zanko in nestrukturirano RNA (loop-linear interactions) [3]. Tipične riboregulatorje sestavlja 30 nukleotidov, kar ustreza sekvenčnemu prostoru 10^18 različnih potencialnih zaporedij. Predhodno razviti RNA-regulatorji ne izkoriščajo tega sekvenčnega prostora in imajo majhen dinamični razpon za modulacijo signala (55x ojačanje RNA-aktivatorjev v primerjavi s 350x ojačanjem proteinskih transkripcijskih regulatorjev) ter majhne sete ortogonalnih elementov z višjim številom prečnih interakcij, kar izvira iz omejitev pri njihovem oblikovanju. Temeljijo na naravnih riboregulatorjih, kjer utišanje izražanja proteina izvira iz vezave na mesto RBS, pri čemer sprožilna RNA sestoji iz zaporedja RBS, ki nadomesti represor [2, 3].  
Slednje sestavljata dve molekuli RNA: pretvornik, ki regulira proces ter trans-aktivna RNA, sprožilec, ki modulira delovanje pretvornika. Razvrščamo jih glede na tip začetnih interakcij med molekulama RNA: hibridizacija zaporedij med zankama (loop-loop interactions) ter hibridizacija zaporedij med zanko in nestrukturirano RNA (loop-linear interactions) [3]. Tipične riboregulatorje sestavlja 30 nukleotidov, kar ustreza sekvenčnemu prostoru 10^18 različnih potencialnih zaporedij. Predhodno razviti RNA-regulatorji ne izkoriščajo tega sekvenčnega prostora in imajo majhen dinamični razpon za modulacijo signala (55x ojačanje RNA-aktivatorjev v primerjavi s 350x ojačanjem proteinskih transkripcijskih regulatorjev) ter majhne sete ortogonalnih elementov z višjim številom prečnih interakcij, kar izvira iz omejitev pri njihovem oblikovanju. Temeljijo na naravnih riboregulatorjih, kjer utišanje izražanja proteina izvira iz vezave na mesto RBS, pri čemer sprožilna RNA sestoji iz zaporedja RBS, ki nadomesti represor [2, 3].  
 +
<h2>RNA-stikala tipa toehold</h2>
<h2>RNA-stikala tipa toehold</h2>
 +
Ključna zahteva za delovanje riboregulatorja je menjava konfiguracije med sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo in tisto, ki translacijo promovira ob vezavi trans-RNA. Študije GWAS so pokazale, da je za pravilen potek translacije, poleg mesta RBS, ključna tudi sekundarna struktura mRNA v regijah okrog začetnega kodona, kar je botrovalo in silico razvoju različnih stikal toehold. Alternativni pristop, ki so ga ubrali pri de-novo-razvoju stikal toehold, temelji na drugemu tipu interakcij med molekulama RNA (linear-linear) in tako poveča dinamični obseg delovanja, zmanjša interakcije komponent preko sistema, poveča število ortogonalnih komponent in ojača robustnost vezij ter omogoči večjo fleksibilnost pri zasnovi [1].
 +
 +
Kompleks sestavljata 2 molekuli RNA, stikalo toehold in sprožilec (trans-aktivna RNA). Stikalo ima na 3'-koncu kodirajoče zaporedje gena, ki ga reguliramo (npr. reporter), pred njim je modul v obliki lasnice z začetnim kodonom in RBS, ki ju s 5'-koncem, kamor se prilega sprožilec, povezuje 21 nt dolg vezni člen. Lasnica je represor translacije in predstavlja enoverižno strukturo znotraj RNA – 11nt, ki niso komplementarni mestu RBS. Med mestoma RBS in začetnim kodonom se tvori RNA dupleks (6bp), enoverižni domeni začetnega kodona pa ponovno sledi dvoverižno deblo lasnice (9 bp). Ne-komplementarnost začetnega kodona nasprotni verigi omogoči večje število razvoja potencialnih sprožilcev, ki so komplementarni represirajočim domenam nasproti RBS in začetnemu kodonu (začetna mesta reakcije izpodrivanja verige) ter deblu stikala. Sprožilec je podaljšana enoverižna RNA, ki ob vezavi razreši lasnico (izpodrine hibdridizirana mesta) in izpostavi RBS ter začetni kodon translacijskim proteinom. Knjižnice translacijskih aktivatorjev so razširili v knjižnice stikal toehold z ortogonalnimi elementi in silico (646 stikal toehold). Stremeli so k razvoju stikal z nizkim številom prečnih interakcij in po simulaciji Monte Carlo (417 316 interakcij) identificirali podset 144 stikal [1].
 +
 +
Komponente stikal so okarakterizirali v sevu E. coli BL21 Star DE3 (sev brez RNAaz), izražanje verig RNA so inducirali z IPTG, izhodni signal, fluorescenco GFP, pa izmerili s pretočno citometrijo. Aktivirana stikala toehold so dala višji nivo fluorescence, razmerje med signaloma ON/OFF pa je tudi do 10-kratnik prehodnih riboregulatorjev. Nizke fluorescenčne signale so dali ne-korespondenčni pari RNA-sprožilec/stikalo. Količnik fluorescence slednjih s fluorescenco aktiviranega stikala so definirali kot merilo za prečne interakcije in s tem ortogonalnost komponent stikal. Setu 26 stikal so določili manj kot 12% nivo prečnih interakcij. Ker je velikost ortogonalnih knjižnic je omejena z načinom določevanja prečnih interakcij, tak nivo predstavlja zgornjo mejo dinamičnega obsega seta stikal in je merilo za atenuacijo transkripcije, ki poteče zaradi ne-tarčnih interakcij RNA [1].
 +
 +
Analizi knjižnic prve generacije stikal je botrovalo iskanje lastnosti zaporedja RNA, ki vplivajo na delovanje stikala. V drugi generaciji so tako modificirali zaporedja na vrhu debla, podaljšali lasnico in domeno toehold za vezavo sprožilca, celotno vezavno mesto pa premaknili dlje od RBS, kar je povečalo njegovo moč (in s tem izhodni signal). Razmerje ON/OFF stikal je tako primerljivo z dinamičnim dosegom proteinskih regulatorjev, prednost riboregulatorjev pa je tudi visoko učinkovit sistem za in silico razvoj, ki ne zahteva obsežnih presejalnih testov / predhodnega eksperimentalnega dela. Ključni faktor je tudi termodinamski vidik reakcije izpodrivanja verige. Kinetično ga nadzoruje lasnica, okarakterizirali pa so ga s termodinamskim faktorjem ΔGRBS-linker. Gre za prosto energijo zaporedja med regijo RBS do konca veznega člena in predstavlja količino energije, ki jo potrebuje ribosom za razvitje mesta RBS in zgodnje mRNA pri začetku translacije. Ob poravnavi trendnih črt vrednosti ΔGRBS-linker in razmerja ON/OFF so izračunali precej visok koeficient korelacije R2 (0,79), kar nakazuje na uporabo faktorja ΔGRBS-linker pri razvoju stikal ter tudi razlago za slabše delovanje nekaterih opcij [1].
<h3>Omejitve pri razvoju stikal toehold</h3>
<h3>Omejitve pri razvoju stikal toehold</h3>
 +
Predhodne riboregulatorje so omejevala tri »napačna« načela razvoja regulatorjev:
 +
 +
#Funkcionalnost temelji na podobnosti naravnim analogom
 +
#Funkcionalnost izhaja iz interakcij RNA med zankami
 +
#Sprožilec se veže na mesto RBS
 +
 +
Ker stikala toehold nimajo naravnih analogov, je to omogočalo razvoj razširjenih knjižnic riboregulatorjev, kjer prevladajo nestrukturirane oz. linearne interakcije. Mesto RBS se nahaja znotraj lasnice, utišanje izražanja gena pa je posledica sekundarnih struktur RNA pred in po začetnem kodonu. Zato je ugodnejša vezava sprožilca pred mesto RBS, saj ima kompleks stikalo-sprožilec šibkejšo sekundarno strukturo, ki olajša vezavo ribosoma ter s tem ojača stanje ON. Te paradigme presežejo napačne predpostavke oblikovanja predhodnih riboregulatorjev in povečajo sekvenčni prostor potencialnih sprožilcev. Ti so prav tako omejeni, kljub temu, da popolna hibdridizacija sprožilca s stikalom ni potreben in zadosten pogoj za delovanje kompleksa. Ne smejo imeti zaporedja AUG (zanka z začetnim kodonom ni komplementarna nasprotni toehold-domeni) in zaporedij za stop kodone v sprožilcu komplementarnih 9 bp, ki sledijo zanki z začetnim kodonom. Za proteine, občutljive na N-koncu je lahko problematično podaljšanje stikala zaradi ugodnejše hibridizacije s sprožilcem, vendar se slednje razreši s tem, da je zaporedje za tarčni gen del debla lasnice RNA [1]. Dostopno je spletno orodje za oblikovanje stikal toehold, ki vključuje strukturne in termodinamske zahteve za delujoče stikalo [4].
<h2>Primeri uporabe</h2>
<h2>Primeri uporabe</h2>
<h3>Senzorji endogene RNA</h3>
<h3>Senzorji endogene RNA</h3>
 +
Stabilnejše sekundarne strukture endogenih RNA otežijo vezavo na domene toehold in s tem reakcijo termodinamsko otežijo. To so nekoliko razrešili s povečanjem domen toehold (> 24 nt) ter s programiranim mehanizmom razvijanja RNA. Preizkusili so dva senzorja, mRNA mCherry in senzor za detekcijo majhne endogene RNA RyhB. Ob transkripciji mRNA mCherry (sprožilec), se je fluorescenca GFP (reporterski gen na stikalu) ojačala, v odsotnosti mCherry pa se GFP ne izraža oz. poda le bazni signal. To omogoča simultano merjenje tako izhodnega signala preko GFP kot tudi transkripcijo sprožilcev preko fluorescence mCherry. Ryhb je 90 nt dolg transkript, ki ob nizkih nivojih železa negativno regulira z železom asociirane gene. Senzor so okarakterizirali z razvojem plazmidov, ki konstitutivno izražajo na RyhB-odzivno stikalo toehold. Sinteza RyhB je bila inducirana z dodatkom kelatorja, ki veže železo, po 1h pa je bila izmerjena fluorescenca, ki je pokazala ojačanje izražanja reporterja [1]. Taki senzorji so se kasneje izkazali uporabni za hitro detekcijo genoma virusa Zika [5].
 +
<h3>Regulacija endogenih genov in multipleksna regulacija</h3>
<h3>Regulacija endogenih genov in multipleksna regulacija</h3>
 +
Za regulacijo endogenih genov (uiA, LacZ in cheY) so navzgor od tarčnega zapisa z λ Red rekombinacijo vstavili linearne fragmente DNA z zaporedjem stikal toehold. Celice so tako ohranile funkcionalno kopijo tarčnih genov, ki pa so zaradi ko-transkripcije stikal utišani. Gena uiA in lacZ zapisujeta za encime β-glukoronidazo in β -galaktozidazo; pri prvem je bil vpliv aktiviranega stikala opažen kvalitativno (modro/zeleno obarvanje kolonij glede na razpad substrata), pri drugem pa je za aktivacijo bil potreben tako induktor (laktoza/IPTG) kot sprožilec, kar nakazuje na obnašanje genetskega vezja »IN«. Slednje je značilno tudi za delovanje gena za kemotakso, cheY, kjer je izhodni signal – premik celice z mesta inokulacije – zahteval oba vhodna signala, sprožilec in induktor [1].
 +
 +
Multipleksno regulacijo s stikali toehold so preizkusili s hkratnim izražanjem 12 stikal v eni celici. Uporabili so štiri reporterje, 10 kb veliko sintezno omrežje pa so izgradili na eni policistronski mRNA (3,4 kb; pod T7 promotorjem). Z izražanjem vseh štirih sprožilcev so lahko hkrati izmerili fluorescence vseh štirih reporterjev [1].
 +
<h3>Biološko vezje "IN" s štirimi vhodnimi signali</h3>
<h3>Biološko vezje "IN" s štirimi vhodnimi signali</h3>
 +
Primer vezja sestoji iz treh stikal toehold, porazdeljenih po dveh ravneh, sklopljenih z dvema ortogonalnima transkripcijskima faktorjema. Da se zadovolji zahtevam dveh logičnih vrat »IN« prve ravni vezja, sta za vsaka vrata potrebna vhodna signala: RNA-stikalo in sprožilec. Izhodna signala sta visoko ortogonalna transkripcijska faktorja ECF sigma, ki sprožita transkripcijo stikala toehold na drugi ravni vezja, aktiviran kompleks stikalo-sprožilec pa se manifestira kot fluorescenca GFP. Ta je najvišja, ko so prisotni vsi štirje vhodni signali [1].
<h2>Zaključek</h2>
<h2>Zaključek</h2>
 +
Sposobnost stikal toehold, da aktivirajo translacijo z odzivom na arbitrarna zaporedja RNA, jih uvršča med univerzalne prenašalce signala med RNA in proteini. Genetska vezja, zgrajena iz stikal toehold tako omogočajo splošen pristop k ne-invazivnemu opazovanju endogenih omrežij RNA. Lahko delujejo kot senzorji za trenutni status celic ali pa tudi modulirajo njihovo aktivnost ter izvajajo kompleksne logične izračune [6]. V metabolnem inženirstvu bi lahko ta stikala uporabili za razvoj samo-optimizirajočih omrežij, ki ob zaznavi stresnih signalov / specifične RNA, celice usmerjajo k največjemu izkoristku proizvodnje metabolitov [1].
<h2>Viri</h2>
<h2>Viri</h2>
 +
 +
[1] A. A. Green, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression,” Cell, vol. 159, no. 4, pp. 925–939, Nov. 2014.
 +
 +
[2] J. M. Callura, C. R. Cantor, and J. J. Collins, “Genetic switchboard for synthetic biology applications,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 15, pp. 5850–5855, Apr. 2012.
 +
 +
[3] M. K. Takahashi and J. B. Lucks, “A modular strategy for engineering orthogonal chimeric RNA transcription regulators,” Nucleic Acids Res., vol. 41, no. 15, pp. 7577–7588, Aug. 2013.
 +
 +
[4] A. C.-Y. To, D. H.-T. Chu, A. R. Wang, F. C.-Y. Li, A. W.-O. Chiu, D. Y. Gao, C. H. J. Choi, S.-K. Kong, T.-F. Chan, K.-M. Chan, and K. Y. Yip, “A comprehensive web tool for toehold switch design.,” Bioinformatics, vol. 34, no. 16, pp. 2862–2864, Aug. 2018.
 +
 +
[5] K. Pardee, A. A. Green, M. K. Takahashi, D. Braff, G. Lambert, J. W. Lee, T. Ferrante, D. Ma, N. Donghia, M. Fan, N. M. Daringer, I. Bosch, D. M. Dudley, D. H. O’Connor, L. Gehrke, and J. J. Collins, “Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.,” Cell, vol. 165, no. 5, pp. 1255–1266, May 2016.
 +
 +
[6] A. A. Green, J. Kim, D. Ma, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Complex cellular logic computation using ribocomputing devices,” Nature, vol. 548, p. 117, Jul. 2017.

Revision as of 20:08, 25 November 2018

Contents

Predhodni riboregulatorji

Uporaba regulatornih zaporedij RNA razreši ozko grlo, ki sicer pesti sintezno-biološke pristope k napovedovanju in nadzoru obnašanja bioloških sistemov: zmanjša število nepredvidenih / nezaželenih interakcij bioloških komponent v kompleksnem celičnem okolju. Na osnovi naravnih regulatorjev so bili razviti pretvorniki mRNA (prevedejo vhodni signal majhne molekule / proteinskega liganda v izhodni proteinski signal) in riboregulatorji, ki nadzirajo procesa prepisovanja in prevajanja genetskega materiala [1] [1, 2].

Slednje sestavljata dve molekuli RNA: pretvornik, ki regulira proces ter trans-aktivna RNA, sprožilec, ki modulira delovanje pretvornika. Razvrščamo jih glede na tip začetnih interakcij med molekulama RNA: hibridizacija zaporedij med zankama (loop-loop interactions) ter hibridizacija zaporedij med zanko in nestrukturirano RNA (loop-linear interactions) [3]. Tipične riboregulatorje sestavlja 30 nukleotidov, kar ustreza sekvenčnemu prostoru 10^18 različnih potencialnih zaporedij. Predhodno razviti RNA-regulatorji ne izkoriščajo tega sekvenčnega prostora in imajo majhen dinamični razpon za modulacijo signala (55x ojačanje RNA-aktivatorjev v primerjavi s 350x ojačanjem proteinskih transkripcijskih regulatorjev) ter majhne sete ortogonalnih elementov z višjim številom prečnih interakcij, kar izvira iz omejitev pri njihovem oblikovanju. Temeljijo na naravnih riboregulatorjih, kjer utišanje izražanja proteina izvira iz vezave na mesto RBS, pri čemer sprožilna RNA sestoji iz zaporedja RBS, ki nadomesti represor [2, 3].

RNA-stikala tipa toehold

Ključna zahteva za delovanje riboregulatorja je menjava konfiguracije med sekundarno strukturo, ki prepreči translacijo in tisto, ki translacijo promovira ob vezavi trans-RNA. Študije GWAS so pokazale, da je za pravilen potek translacije, poleg mesta RBS, ključna tudi sekundarna struktura mRNA v regijah okrog začetnega kodona, kar je botrovalo in silico razvoju različnih stikal toehold. Alternativni pristop, ki so ga ubrali pri de-novo-razvoju stikal toehold, temelji na drugemu tipu interakcij med molekulama RNA (linear-linear) in tako poveča dinamični obseg delovanja, zmanjša interakcije komponent preko sistema, poveča število ortogonalnih komponent in ojača robustnost vezij ter omogoči večjo fleksibilnost pri zasnovi [1].

Kompleks sestavljata 2 molekuli RNA, stikalo toehold in sprožilec (trans-aktivna RNA). Stikalo ima na 3'-koncu kodirajoče zaporedje gena, ki ga reguliramo (npr. reporter), pred njim je modul v obliki lasnice z začetnim kodonom in RBS, ki ju s 5'-koncem, kamor se prilega sprožilec, povezuje 21 nt dolg vezni člen. Lasnica je represor translacije in predstavlja enoverižno strukturo znotraj RNA – 11nt, ki niso komplementarni mestu RBS. Med mestoma RBS in začetnim kodonom se tvori RNA dupleks (6bp), enoverižni domeni začetnega kodona pa ponovno sledi dvoverižno deblo lasnice (9 bp). Ne-komplementarnost začetnega kodona nasprotni verigi omogoči večje število razvoja potencialnih sprožilcev, ki so komplementarni represirajočim domenam nasproti RBS in začetnemu kodonu (začetna mesta reakcije izpodrivanja verige) ter deblu stikala. Sprožilec je podaljšana enoverižna RNA, ki ob vezavi razreši lasnico (izpodrine hibdridizirana mesta) in izpostavi RBS ter začetni kodon translacijskim proteinom. Knjižnice translacijskih aktivatorjev so razširili v knjižnice stikal toehold z ortogonalnimi elementi in silico (646 stikal toehold). Stremeli so k razvoju stikal z nizkim številom prečnih interakcij in po simulaciji Monte Carlo (417 316 interakcij) identificirali podset 144 stikal [1].

Komponente stikal so okarakterizirali v sevu E. coli BL21 Star DE3 (sev brez RNAaz), izražanje verig RNA so inducirali z IPTG, izhodni signal, fluorescenco GFP, pa izmerili s pretočno citometrijo. Aktivirana stikala toehold so dala višji nivo fluorescence, razmerje med signaloma ON/OFF pa je tudi do 10-kratnik prehodnih riboregulatorjev. Nizke fluorescenčne signale so dali ne-korespondenčni pari RNA-sprožilec/stikalo. Količnik fluorescence slednjih s fluorescenco aktiviranega stikala so definirali kot merilo za prečne interakcije in s tem ortogonalnost komponent stikal. Setu 26 stikal so določili manj kot 12% nivo prečnih interakcij. Ker je velikost ortogonalnih knjižnic je omejena z načinom določevanja prečnih interakcij, tak nivo predstavlja zgornjo mejo dinamičnega obsega seta stikal in je merilo za atenuacijo transkripcije, ki poteče zaradi ne-tarčnih interakcij RNA [1].

Analizi knjižnic prve generacije stikal je botrovalo iskanje lastnosti zaporedja RNA, ki vplivajo na delovanje stikala. V drugi generaciji so tako modificirali zaporedja na vrhu debla, podaljšali lasnico in domeno toehold za vezavo sprožilca, celotno vezavno mesto pa premaknili dlje od RBS, kar je povečalo njegovo moč (in s tem izhodni signal). Razmerje ON/OFF stikal je tako primerljivo z dinamičnim dosegom proteinskih regulatorjev, prednost riboregulatorjev pa je tudi visoko učinkovit sistem za in silico razvoj, ki ne zahteva obsežnih presejalnih testov / predhodnega eksperimentalnega dela. Ključni faktor je tudi termodinamski vidik reakcije izpodrivanja verige. Kinetično ga nadzoruje lasnica, okarakterizirali pa so ga s termodinamskim faktorjem ΔGRBS-linker. Gre za prosto energijo zaporedja med regijo RBS do konca veznega člena in predstavlja količino energije, ki jo potrebuje ribosom za razvitje mesta RBS in zgodnje mRNA pri začetku translacije. Ob poravnavi trendnih črt vrednosti ΔGRBS-linker in razmerja ON/OFF so izračunali precej visok koeficient korelacije R2 (0,79), kar nakazuje na uporabo faktorja ΔGRBS-linker pri razvoju stikal ter tudi razlago za slabše delovanje nekaterih opcij [1].

Omejitve pri razvoju stikal toehold

Predhodne riboregulatorje so omejevala tri »napačna« načela razvoja regulatorjev:

  1. Funkcionalnost temelji na podobnosti naravnim analogom
  2. Funkcionalnost izhaja iz interakcij RNA med zankami
  3. Sprožilec se veže na mesto RBS

Ker stikala toehold nimajo naravnih analogov, je to omogočalo razvoj razširjenih knjižnic riboregulatorjev, kjer prevladajo nestrukturirane oz. linearne interakcije. Mesto RBS se nahaja znotraj lasnice, utišanje izražanja gena pa je posledica sekundarnih struktur RNA pred in po začetnem kodonu. Zato je ugodnejša vezava sprožilca pred mesto RBS, saj ima kompleks stikalo-sprožilec šibkejšo sekundarno strukturo, ki olajša vezavo ribosoma ter s tem ojača stanje ON. Te paradigme presežejo napačne predpostavke oblikovanja predhodnih riboregulatorjev in povečajo sekvenčni prostor potencialnih sprožilcev. Ti so prav tako omejeni, kljub temu, da popolna hibdridizacija sprožilca s stikalom ni potreben in zadosten pogoj za delovanje kompleksa. Ne smejo imeti zaporedja AUG (zanka z začetnim kodonom ni komplementarna nasprotni toehold-domeni) in zaporedij za stop kodone v sprožilcu komplementarnih 9 bp, ki sledijo zanki z začetnim kodonom. Za proteine, občutljive na N-koncu je lahko problematično podaljšanje stikala zaradi ugodnejše hibridizacije s sprožilcem, vendar se slednje razreši s tem, da je zaporedje za tarčni gen del debla lasnice RNA [1]. Dostopno je spletno orodje za oblikovanje stikal toehold, ki vključuje strukturne in termodinamske zahteve za delujoče stikalo [4].

Primeri uporabe

Senzorji endogene RNA

Stabilnejše sekundarne strukture endogenih RNA otežijo vezavo na domene toehold in s tem reakcijo termodinamsko otežijo. To so nekoliko razrešili s povečanjem domen toehold (> 24 nt) ter s programiranim mehanizmom razvijanja RNA. Preizkusili so dva senzorja, mRNA mCherry in senzor za detekcijo majhne endogene RNA RyhB. Ob transkripciji mRNA mCherry (sprožilec), se je fluorescenca GFP (reporterski gen na stikalu) ojačala, v odsotnosti mCherry pa se GFP ne izraža oz. poda le bazni signal. To omogoča simultano merjenje tako izhodnega signala preko GFP kot tudi transkripcijo sprožilcev preko fluorescence mCherry. Ryhb je 90 nt dolg transkript, ki ob nizkih nivojih železa negativno regulira z železom asociirane gene. Senzor so okarakterizirali z razvojem plazmidov, ki konstitutivno izražajo na RyhB-odzivno stikalo toehold. Sinteza RyhB je bila inducirana z dodatkom kelatorja, ki veže železo, po 1h pa je bila izmerjena fluorescenca, ki je pokazala ojačanje izražanja reporterja [1]. Taki senzorji so se kasneje izkazali uporabni za hitro detekcijo genoma virusa Zika [5].

Regulacija endogenih genov in multipleksna regulacija

Za regulacijo endogenih genov (uiA, LacZ in cheY) so navzgor od tarčnega zapisa z λ Red rekombinacijo vstavili linearne fragmente DNA z zaporedjem stikal toehold. Celice so tako ohranile funkcionalno kopijo tarčnih genov, ki pa so zaradi ko-transkripcije stikal utišani. Gena uiA in lacZ zapisujeta za encime β-glukoronidazo in β -galaktozidazo; pri prvem je bil vpliv aktiviranega stikala opažen kvalitativno (modro/zeleno obarvanje kolonij glede na razpad substrata), pri drugem pa je za aktivacijo bil potreben tako induktor (laktoza/IPTG) kot sprožilec, kar nakazuje na obnašanje genetskega vezja »IN«. Slednje je značilno tudi za delovanje gena za kemotakso, cheY, kjer je izhodni signal – premik celice z mesta inokulacije – zahteval oba vhodna signala, sprožilec in induktor [1].

Multipleksno regulacijo s stikali toehold so preizkusili s hkratnim izražanjem 12 stikal v eni celici. Uporabili so štiri reporterje, 10 kb veliko sintezno omrežje pa so izgradili na eni policistronski mRNA (3,4 kb; pod T7 promotorjem). Z izražanjem vseh štirih sprožilcev so lahko hkrati izmerili fluorescence vseh štirih reporterjev [1].

Biološko vezje "IN" s štirimi vhodnimi signali

Primer vezja sestoji iz treh stikal toehold, porazdeljenih po dveh ravneh, sklopljenih z dvema ortogonalnima transkripcijskima faktorjema. Da se zadovolji zahtevam dveh logičnih vrat »IN« prve ravni vezja, sta za vsaka vrata potrebna vhodna signala: RNA-stikalo in sprožilec. Izhodna signala sta visoko ortogonalna transkripcijska faktorja ECF sigma, ki sprožita transkripcijo stikala toehold na drugi ravni vezja, aktiviran kompleks stikalo-sprožilec pa se manifestira kot fluorescenca GFP. Ta je najvišja, ko so prisotni vsi štirje vhodni signali [1].

Zaključek

Sposobnost stikal toehold, da aktivirajo translacijo z odzivom na arbitrarna zaporedja RNA, jih uvršča med univerzalne prenašalce signala med RNA in proteini. Genetska vezja, zgrajena iz stikal toehold tako omogočajo splošen pristop k ne-invazivnemu opazovanju endogenih omrežij RNA. Lahko delujejo kot senzorji za trenutni status celic ali pa tudi modulirajo njihovo aktivnost ter izvajajo kompleksne logične izračune [6]. V metabolnem inženirstvu bi lahko ta stikala uporabili za razvoj samo-optimizirajočih omrežij, ki ob zaznavi stresnih signalov / specifične RNA, celice usmerjajo k največjemu izkoristku proizvodnje metabolitov [1].

Viri

[1] A. A. Green, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Toehold switches: de-novo-designed regulators of gene expression,” Cell, vol. 159, no. 4, pp. 925–939, Nov. 2014.

[2] J. M. Callura, C. R. Cantor, and J. J. Collins, “Genetic switchboard for synthetic biology applications,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 109, no. 15, pp. 5850–5855, Apr. 2012.

[3] M. K. Takahashi and J. B. Lucks, “A modular strategy for engineering orthogonal chimeric RNA transcription regulators,” Nucleic Acids Res., vol. 41, no. 15, pp. 7577–7588, Aug. 2013.

[4] A. C.-Y. To, D. H.-T. Chu, A. R. Wang, F. C.-Y. Li, A. W.-O. Chiu, D. Y. Gao, C. H. J. Choi, S.-K. Kong, T.-F. Chan, K.-M. Chan, and K. Y. Yip, “A comprehensive web tool for toehold switch design.,” Bioinformatics, vol. 34, no. 16, pp. 2862–2864, Aug. 2018.

[5] K. Pardee, A. A. Green, M. K. Takahashi, D. Braff, G. Lambert, J. W. Lee, T. Ferrante, D. Ma, N. Donghia, M. Fan, N. M. Daringer, I. Bosch, D. M. Dudley, D. H. O’Connor, L. Gehrke, and J. J. Collins, “Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.,” Cell, vol. 165, no. 5, pp. 1255–1266, May 2016.

[6] A. A. Green, J. Kim, D. Ma, P. A. Silver, J. J. Collins, and P. Yin, “Complex cellular logic computation using ribocomputing devices,” Nature, vol. 548, p. 117, Jul. 2017.

Personal tools