View source for Raziskave, ki so privedle do odkritja RNA-interference (1995-1998)

Do odkritja RNA interference (RNAi) oziroma pojava za katerega pravijo, da spada med najzanimivejša odkritja na področju genomike, je prišlo postopoma preko različnih raziskav na različnih organizmih, za katere se je šele na koncu, ko so razvozlali vse mehanizme izkazalo, da gre v bistvu pri vseh za identičen pojav. Torej gre za pojav, kjer dvoverižna RNA (dsRNA) sproži posttranskripcijsko utišanje genov v celici. Za samo odkritje in pojasnitev mehanizmov pa so ključnega pomena tri temeljne raziskave in sicer: 
The Petunia Story (1990), The First Evidenceds RNA - Gene Silencer (1995) in še zadnja 
C.elegans experiment (1998), ki sta jo izvedla Craig C. Mello in Andrew Fire in za katero sta leta 2006 dobila tudi Nobelovo nagrado.



== 1. The petunia story (1990) ==

RNA interferenca je bila najprej opažena na petunijah, ki so jih znanstveniki v ZDA želeli narediti bolj vijolične barve, vendar  takrat samega mehanizma še niso znali točno razložiti in so pojav imenovali co-suppression oziroma ko-supresija genov, ker se je zdelo, da endogen in vstavljen gen preprečujeta izražaje drug drugega. Naloge so se lotili tako, da so želeli povečati ekspresijo gena za encim chalcone sintaza oziroma chs, ki je ključni encim pri sintezi flavonoidov, ki so najpomembnejši rastlinski pigmenti in so ključnega pomena za obarvanje. S tem namenom so v petunije vstavili dodatne kopije tega gena in sicer tako da so chs gen združili z promotorjem mozaičnega virusa (CaMV-35S) in dobili takoimenovan chsA gen. Tega pa so skupaj z markerskim genom nptll, ki zapisuje rezistenco za antibiotik kanamicin vstavili v plazmid bakterije Agrobacterium tumefaciens, ga namnožili in vstavili v rastline. Izkazalo pa se je, da je pri večini petunij namesto do povečane genske ekspresije prišlo do zmanjšane sinteze antocianov, saj so vstavljeni chsA geni povzročili koinhibicijo endogenih genov. In sicer kar 42% rastlin z vstavljenim chsA genom se je namesto bolj vijolično obarvalo povsem belo, ali pa so dobile različne bele vzorce, pri nobeni pa ni bilo opaziti temnejše barve. Z analizo potomcev transgene rastline so ugotovili, da se nov barvni fenotip prenaša tudi na potomce.  Ko so raziskovali mehanizem kosupresije so ugotovili, da je transkiripcija teh genov normalna in da inhibicije ekspresije ne povzroča deaktivacija promotorja in tudi da je supresija neodvisna od transkripcijske aktivnosti. To je znanstvenike privedlo do zaključka, da se co-suppresija zgodi šele med tem tem ko že poteka transkripcija, ali pa šele posttranskripcijsko.  Ugotovili so, da pride v celici le do suppressije tistih genov, ki so homologni ektopičnim (so na napačnem mestu) transgenim genom, kar je nakazovalo na to, da mora med sekvencami DNA prihajati do medsebojnih interakcij ali pa vsaj interakcij med transkripti. Nato so izvedli nuclear run-on teste, ki so pokazali, da so transkripti gena v transgeni rastlini prisotni v podobni meri kot pri navadni rastlini, se pravi, da se gen normalno prepisuje in da mora do interakcij priti na posttranskripcijski ravni. Ko so raziskovali zakaj dejansko pride do genskega utišanja so ugotovili, da pride pri transkripciji ektopičnih genov do nastanka asRNA, ki inhibira translacijo mRNA, vendar pa jim ni uspelo najti povezave med supresijo in asRNA, ker je bilo te v celicah po njihovem mnenju premalo da bi sama povzročila ko-supresijo. Tako je ostal mehanizem genskega utišanja takrat še neznan. 



== 2. The First Evidenceds RNA - Gene Silencer (1995) ==


Naslednje poskuse so delali na C. elegans. Prva delitev teh organizmov je asimetrična, kjer sta hčerinski celici različnih velikosti. To vključuje tudi citoplazemske komponente in maščobe ter P-granule, ki se lokalizirajo v kasnejši manjši celici. Ob prisotnosti mikrofilamentskega strupa citoshalasin privede do občasnih simetričnih delitvah. Raziskovalci Su Guo-na in Kenneth J. Kemphuesa pa so mutirali gen PAR-1 in ugotovili, da zaradi te mutacije ne pride do asimetrične delitve ter pravilne lokalizacije P-granul (slika pod odstavkom). PAR-1 naj bi kodirala domnevno Ser/Thr kinazo. PAR-1 protein je prisoten v kasnejši periferiji zigote in je razdeljen v polarno obliko prejšnje asimetrične delitve.
V svojih raziskavah so razrezali kromosom Y51F3 na 100kb in na 150kb fragmentov. Gor so vezali sondo in poskušali odkriti par-1 gen. Potem so izolirali cDNA, ki odgovarja na ta transkript. Naslednji korak so hoteli odkriti klon, ki predstavlja ZC22 regijo. Nič niso odkrili zato so se odločili, da bojo iskali z par-1 genom z protismerno inhibicijo. 52% embriov, ki so imeli vbrizgane ZN22 protismerna RNA, se jim ni razvil fenotip za par-1: To je, da ni mofrogeneze, črevesnih celic in presežek žrelnih celic. Nato pa so vbrizgali smerno RNA in je prav tako prišlo do velike stopnje umrljivosti zarodkov (54%). Ko pa so vbrizgali tako smerno kot protismerno RNA. Prišlo je do rezultatov po katerih so sklepali, da sta mehanizma inhibicije ločena. Ta inhibicija s protismerno in smerno RNA je najbolj pomembna za nadaljnje raziskave o interferenčni RNA.
Su Guo in Kenneth J. Kemphues in kolegi so svoje raziskave dosti usmerjali k proteinu PAR-1, ampak za nas to ni tako pomembno. 



== 3. C.elegans experiment (1998) ==


Poskusi so potekali na modelnem organizmu Caenorhabditis elegans, ki je vrsta gliste iz družine ogorčic. Ta organizem ima za raziskovanje mnogo prednosti (večina hermafroditov, hitro razmnoževanje, razmeroma majhno število celic -959).
Vstavitev specifičnega segmenta RNA v celico privede do sprembe v izražanju endogenega gena. Mislili so, da do tega pride, ker se protismerna ("antisense") RNA veže na endogene mRNA transkripte (hibridizacija). V raziskavi so raziskovali vplive interferenčnih RNA z različnimi strukturami. Odkrili so, da je interferenčna dvoverižna RNA bistveno bolj učinkovita od samih enoverižnih. Potrebnih je že samo nekaj molekul dvoverižne RNA na celico, da opazimo spremembe translacije. To kaže na katalitično/amplifikacijsko vlogo interferenčne RNA. 
V nadaljevanju sta znanstvenike begala dva pomembna vprašanja. In sicer:  
Zakaj že prisotnost posameznih  "sense" ali "antisense" verig povzroči interferenco?
Zakaj se efekti interference prenesejo na potomce, če se večina RNA transkriptov v stopnji zgodnjega embronalnega razvoja razgradi?
Rezultati kažejo na precej drugačno obnašanje nativne in interferenčne RNA. 
Vzorce RNA so pripravili z bakteriofagno RNA polimerazo, za katero je kljub visoki specifičnosti v manjši meri značilna tudi sinteza poljubnih transkriptov. 
Primerjali so izražanje večih genov v prisotnosti njihove interferenčne RNA:
Gen unc22 - kodira neesencialni miofilamentni protein, ki je v celicah pisoten v velikih količinah. Zmanjšanje izražanja rezultira v trzanju, če pa je ni, se to kaže v oteženem premikanju in mišičnih defektih. Dodatek velikih doz čistih sense ali antisense RNA je rezultiral v relativno majhni interferenci, bistveno večjo pa so zaznali pri dodatku manjših doz dvoverižne RNA (mešanice). Efektivnost iste doze mešanice je vsaj za dva reda večja. 
Poskusili so tudi postopno doziranje sense ali antisense segmentov. Pri krajših časovnih intervalih doziranja je prihajalo do zadostnega združevanja in posledično zadovoljive interference, če pa so bili intervali daljši (1h), pa so opazili drastično znižanje interferenčne aktivnosti. To kaže na možno razgradnjo enoverižnih segmentov.
Pri eksperimentiranju z interferenčnimi RNA naslednjih genov so dobili podobne rezultate.
Gen unc54 - kodira miozinski izoformni protein, ki sestavlja mišico telesne stene. Ta je pomembna za popolno kontrakcijo.
Fen-1 - kodira protein, ki je pri hermafroditih pomemben za produkcijo sperme.
hlh-1 - kodira protein, pomemben za pravilno telesno strukturo in premikanje.
Izjema: segment unc54c. Pri tem dodatek dvoverižne interferenčne RNA povzroči prekinitev nadalnjega razvoja iz embrionične faze ali pa iz faze ličinke. Ta segment kodira miozinsko motorično domeno, ki je zelo ohranjena. Sklepamo lahko, da interferenca ni specifična za ta gen.
Flourescenca: Uporabili so transgeno linijo celic, ki je izražala dva različna GFP. Injeciranje dsRNA proti tema genoma je rezultirala v neobarvanosti celic, ki so so razvile med embriogenezo. Postembriotično izvorne prečno progaste mišice kažejo višjo stopnjo resistence, gladke mišice vulve (ki se razvijejo po dobi ličinke) pa kažejo imunost na interferenco. Dokazali so tudi sposobnost prehajanja dsRNA preko membran (injeciranje določene dsRNA v glavo ali rep povzroči interferenco v izražanju gena pri potomcih).






==  Viri in literatura ==

1.	Guo S, Kemphues KJ. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995 Maj 19;81(4):611-20. PubMed PMID: 7758115.

2.	Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11. PubMed PMID: 9486653.

3.	Jorgensen, R. et al. lntroduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes Ín trans. The plant cell, 1990, letn. 2, str. 279-289

4.	Van Blokland, R. et al. Transgene-mediated suppression of-chalcone synthase expression in Petunia hybrida results from an increase in RNA turnover. The plant journal, 1994, letn. 6, str. 861-877

5.	Wikipedija, prosta enciklopedija [online], RNA interference [28. 3. 2012]:  http://en.wikipedia.org/wiki/RNA_interference
Caenorhabditis elegans [28.3.2012]: http://sl.wikipedia.org/wiki/Caenorhabditis_elegans
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]