Razreševanje Hollidayevega križišča

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
(Uvod)
(Uvod)
Line 1: Line 1:
== Uvod ==
== Uvod ==
-
Hollidayevo križišče je struktura DNA, ki se pojavi pri homologni rekombinaciji  genov.[1,2] Nastane iz dveh dsDNK (dvoverižna DNK, ang. double strand DNA), ki se povežeta tako, da 4 ssDNK (enoverižne DNK molekule, ang. single strand DNA) tvorijo obliko križa ([//http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1d] [3]).[1,2] To strukturo je leta 1964 predlagal Robin Holliday, kot možno razlago za nenavadno dedovanje pri mejotskih delitvah nekaterih gliv.[2] Po teoriji Gregorja Mendela, začetnika genetike, bi se morali geni starševskih celic dedovati v razmerju A:a=2:2, kar pa pri nekaterih organizmih ne drži vedno – pojavi se lahko tudi razmerje dedovanja A:a=3:1.[2] Prvi takšen primer je opisal nemški genetik Hans Winkler in leta 1930 predstavil svojo idejo o spreminjanju genov kot razlago za to deviacijo, pravo molekularno obrazlago pa izpopolnil Holliday.[2]
+
Hollidayevo križišče je struktura DNA, ki se pojavi pri homologni rekombinaciji  genov.[1,2] Nastane iz dveh dsDNK (dvoverižna DNK, ang. double strand DNA), ki se povežeta tako, da 4 ssDNK (enoverižne DNK molekule, ang. single strand DNA) tvorijo obliko križa ([http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22099/figure/A3264/?report=objectonly slika 1d] [3]).[1,2] To strukturo je leta 1964 predlagal Robin Holliday, kot možno razlago za nenavadno dedovanje pri mejotskih delitvah nekaterih gliv.[2] Po teoriji Gregorja Mendela, začetnika genetike, bi se morali geni starševskih celic dedovati v razmerju A:a=2:2, kar pa pri nekaterih organizmih ne drži vedno – pojavi se lahko tudi razmerje dedovanja A:a=3:1.[2] Prvi takšen primer je opisal nemški genetik Hans Winkler in leta 1930 predstavil svojo idejo o spreminjanju genov kot razlago za to deviacijo, pravo molekularno obrazlago pa izpopolnil Holliday.[2]
== Formacija Hollidayevega križišča ==
== Formacija Hollidayevega križišča ==

Revision as of 14:56, 28 May 2016

Contents

Uvod

Hollidayevo križišče je struktura DNA, ki se pojavi pri homologni rekombinaciji genov.[1,2] Nastane iz dveh dsDNK (dvoverižna DNK, ang. double strand DNA), ki se povežeta tako, da 4 ssDNK (enoverižne DNK molekule, ang. single strand DNA) tvorijo obliko križa (slika 1d [3]).[1,2] To strukturo je leta 1964 predlagal Robin Holliday, kot možno razlago za nenavadno dedovanje pri mejotskih delitvah nekaterih gliv.[2] Po teoriji Gregorja Mendela, začetnika genetike, bi se morali geni starševskih celic dedovati v razmerju A:a=2:2, kar pa pri nekaterih organizmih ne drži vedno – pojavi se lahko tudi razmerje dedovanja A:a=3:1.[2] Prvi takšen primer je opisal nemški genetik Hans Winkler in leta 1930 predstavil svojo idejo o spreminjanju genov kot razlago za to deviacijo, pravo molekularno obrazlago pa izpopolnil Holliday.[2]

Formacija Hollidayevega križišča

Najbolje raziskan model formacije in razrešitve Hollidayevega križišča je iz E. coli zato si bomo tega ogledali podrobneje. Hollidayev model pravi, da se po DNK replikaciji, ki podvoji vse pare heterozigotnih alelov, sproži rekombinacija le-teh s simetričnim rezanjem dveh homolognih DNK molekul, ki vsebujeta dva različna alela (slika 1b [3]).[1,2] To omogoči križno povezovanje dvojnih vijačnic preko ssDNK (slika 1c [3]) in tvorbo križne strukture, ki ji pravimo Hollidayevo križišče (slika 1d [3]).[1,2] Formacijo katalizira proteinski kompleks RecBCD, sestavljen iz treh proteinov.[1] RecB deluje kot 3'->5' helikaza in nukleaza, RecD kot 5'->3' helikaza, RecC pa oba povezuje v skupen kompleks.[1] dsDNK vstopi v kompleks skozi tunel med RecB in RecC proteinoma, zanka na RecC pa nukleotidni verigi loči – 3' konec se veže na RecB, 5' konec pa na RecD (slika 2.2 [4]).[1] Posamezni ssDNK potujeta skozi ločena tunela, ki ju tvori RecC z omenjenima proteinoma ter na drugem koncu prideta v stik z nukleazno domeno RecB.[1] Na slednji se 3' konec cepi hitreje kot 5' konec, saj 3' konec izstopi iz tunela bližje aktivnemu mestu, kakor 5' konec; za cepitev kompleks porablja ATP (slika 2.3 [4]).[1,2] Aktivnost proteina se spremeni, ko naleti na zaporedje χ (GCTGGTGG) na 3' koncu.[1] Ta se močneje poveže z RecC proteinom in ustavi procesiranje 3' konca proteina.[1] Ob tem se poveča frekvenca cepljenja 5' konca DNK, saj se 3' ne cepi več in sprosti nukleazno mesto (slika 2.5 [4]).[1] To omogoči tvorbo ssDNK prostega konca, ki je nujen za tvorbo križišča, saj se le na enoverižno DNK lahko vežejo RecA proteini (slika 2.6 [4]).[1] Ti so ključni za stabilizacijo ssDNK ter izmenjavo nukleotidnih verig v tvorbi križišča.[1] Povezavo dveh verig DNA s komplementarnimi baznimi pari po Watson-Cricku katalizirajo s hidrolizo ATP.[1] Svojo funkcijo prično opravljati ob vezavi ssDNK v vezavno mesto z istočasno vezanim ATP.[1] Ko ta kompleks sreča dsDNK s komplementarnim zaporedjem, povzroči RecA delno razvitje dsDNK in ob hidrolizi ATP izmenja en del razvite dsDNK z ssDNK, kar tvori intermediatno troverižno DNK, obdano z enotami RecA.[1] Za formacijo križišča sta tako potrebni dve takšni reakciji.[1]

Struktura Hollidayevega križišča

Kot že omenjeno je Hollidayevo križišče sestavljeno iz 4 nukleotidnih verig, ki se in vivo prekrižajo v odprti planarni strukturi tako, da križišče zavzame obliko kvadrata, pri katerem iz kotov izhajajo dsDNK (slika 3 [5]).[1,2] Takšna struktura seveda ni stabilna sama po sebi, ampak jo stabilizira RuvA homotetramer.[1,2] Kompleks zavzame obliko pekača za kolač, s krožno vdolbino za križajoče se ssDNK in izstopajočim delom v sredini kvadrata Hollidayeve zanke. Ta je sestavljen iz aminokislin Glu55 in Asp56 vsakega RuvA, ki povzročajo elektrostatski odboj s fosfatnimi skupinami ssDNK; tako se doseže separacija ssDNK in njihovo vodenje do izmenjave nukleotidnih verig.[1] Vdolbine so prekrite s pozitivnimi aminokislinskimi ostanki, ki DNK verige preko elektrostatskih interakcij stabilizirajo v notranjosti le-teh.[1] Predpostavlja se, da je pravilna in vivo struktura dejansko homooktamer, ki tako ne tvori zgolj vdolbin, ampak tunel za DNK verige (dva pekača obrnjena z vdolbinami drug proti drugemu).

Migracija Hollidayevega križišča

Po sami formaciji, Hollidayevo križišče lahko migrira vzdolž DNK verig (slika 1e [3]).[1] Čeprav je sprememba Gibbsove proste energije za ta proces enaka nič, kar bi nakazovalo spontan proces v obeh možnih smereh, je premikanje Hollidayevega križišča po verigi DNK odvisno od hidrolize ATP in zgolj enosmerno.[1] Pri tem sodelujeta dva proteina, že omenjeni RuvA in RuvB.[1] Premik križišča izvaja RuvB s hidrolizo ATP, vendar se mora zaradi šibkih interakcij z DNK na slednjo vezati preko RuvA – slednji torej deluje kot stabilizator križišča in kot vezavno mesto za RuvB. RuvB je aktiven kot heksameren protein, ki v svoji strukturi tvori 30Å kanal, skozi katerega je napeljana veriga DNK.[1] Za premikanje Hollidayevega križišča se tvori kompleks križišča, RuvA tetramera in dveh RuvB heksamerov, ki s svojo aktivnostjo premikata križišče v isto smer (slika 4).[1] Smer premikanja križišča je odvisna od tega, na kateri par krakov Hollidayevega križišča se pripneta RuvB heksamera.[1]

Nukleolitična resolucija Hollidayevega križišča

V različnih organizmih je bilo odkritih že kar nekaj proteinov, ki prepoznavajo Hollidayevo križišče in ga razrešujejo; tem proteinom s skupnim imenom pravimo resolvaze (iz ang. resolve – razrešiti).[1,2] Morda najbolj znana resolvaza je RuvC iz E. coli.[1,2] Gre za homodimerno endonukleazo, ki ima obe aktivni mesti na isti strani encima – to namiguje na mehanizem simetrične cepitve dveh nasprotnih nukleotidnih verig v Hollidayevem križišču tako, da se RuvC orientira na odprto stran kompleksa RuvAB-Hollidayevo križišče.[1] Nastali kompleks RuvABC-Hollidayevo križišče je tako imenovan resolvosom.[1] Križišče se lahko cepi longitudinalno (slika 5, levo, ‘patch’) ali transverzalno (slika 5, desno, ‘splice’) – od načina cepitve je odvisno ali bo prišlo do rekombinacije, ali ne.[1] Pri transverzalnem cepljenju (cepljenju ssDNK verig, ki se izmenjata v formaciji križišča) vidimo, da pride zgolj do zamenjav regij, ki jih definira dolžina poti Hollidayevega križišča; dve homologni DNK molekuli si zgolj izmenjata enaka homologna odseka ssDNK, kar ne vodi do rekombinantnih produktov.[1] V primeru longitudinalnega cepljenja (cepitev verig, ki se pri tvorbi Hollidayeve zanke nista izmenjali) pa pride do prenosa dsDNK molekul in tako do formacije rekombinantnih dvovijačnih DNK – molekul DNK, sestavljenih iz dveh regij iz različnih začetnih dsDNK.[1] Na koncu reševanja zanke DNK ligaze produkte povežejo v enotne dsDNK.[1]

Viri

1. Voet, D. in Voet, J. G. Biochemistry. (John Wiley & Sons, Inc., 2011).
2. Liu, Y. in West, S. C. Happy Hollidays: 40th anniversary of the Holliday junction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 937–946 (2004).
3. Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C. in Gelbart, W. M. An Introduction to Genetic Analysis. (W. H. Freeman and Company, 2000).
4. Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Gaudier, M., Kowalczykowski, S. C. & Wigley, D. B. Crystal structure of RecBCD enzyme reveals a machine for processing DNA breaks. Nature 432, 187–93 (2004).
5. Ariyoshi, M., Nishino, T., Iwasaki, H., Shinagawa, H. & Morikawa, K. Crystal structure of the holliday junction DNA in complex with a single RuvA tetramer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 8257–8262 (2000).

Personal tools