Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00299-023-03100-y Development of new binary expression systems for plant synthetic biology]

Uvod

Rastline imajo velik pomen v biotehnologiji, saj se z njimi ukvarjajo raziskave, povezane s prehransko varnostjo, prilagajanje vremenskim spremembam, razvoj fitosenzorjev in celo razvoj cepiv ter zdravil. Na žalost pa rastlinska biotehnologija že več desetletij ohranja standarden pristop k prekomernem izražanju transgenov. Zato so se v tem članku osredotočili na razvoj novega, modernejšega pristopa k prekomernem izražanju transgenov v rastlinah. Odločili so se, da bodo z ustvarjanjem konstruktov, ki so jih pridobili iz gruče genov mlc, razvili zapis za nov sintetičen mlcR, ki deluje kot aktivator transkripcije. Ta gruča genov je v glivi Penicillium citrinum odgovorna za biosintezo kompaktina [1].

Kompaktin

Kompaktin je znan tudi pod imenom Mevastatin ali ML-236B, spada pa v razred statinov, saj znižuje nivo holesterola v krvi. Njegova biokemijska vloga je kot kompetitivni inhibitor (HMG)-CoA reduktaze – encim, ki regulira biosintezo holesterola. V 38 kilobazno gručo genov, ki sodeluje v biosintezi kompaktina v P. citrinum, spadajo geni mlcA-H in mlcR, vključno z dvema genoma za poliketid sintazo in enim regulatornim genom, ki je odgovoren za biosintezo kompaktina [1], [2]. Protein mlcR deluje kot transkripcijski faktor oziroma aktivator, sestavljen je iz DNA-vezavne domene in aktivacijske domene. Specifično se veže na operator dolg 14 baznih parov, ki se nahaja med genoma mlcA in mlcC. Njegova vezava povzroči večje izražanje gena mlcA v primerjavi z mlcC (transkripcija poteka v nasprotnih smereh). Obstaja pa tudi povezava med mlcR in kompaktinom – več prisotnega mlcR povzroči tudi večje količine kompaktina [1].

Binarni ekspresijski sistem

Standarden pristop za prekomerno izražanje transgena v rastlinah vključuje klasično uporabljanje konstitutivnega promotorja. Za natančnejše in bolj regulirano izražanje genov se lahko poslužimo binarnega ekspresijskega sistema. Pri rastlinah je ta praviloma sestavljen iz dveh komponent: en del vključuje transkripcijski faktor, drugi del pa operator, kamor se veže ta transkripcijski faktor in povzroča izražanje želenega gena. Najbolj znan binarni ekspresijski sistem je UAS/GAL4 [1]. Tega se sicer najpogosteje uporablja pri izražanju genov v Drosophili melanogaster. UAS (angl. upstream activating sequence) je zaporedje, ki je zapisano tik prej promotorjem za gen, ki ga želimo izražati, GAL4 pa transkripcijski faktor iz kvasovk. Ob vezavi GAL4 na UAS pride do aktivacije izražanja tarčnega gena. Ta sistem omogoča veliko fleksibilnost, saj lahko izražamo katerikoli želeni gen, poleg tega pa nam omogoča tkivno specifično izražanje in enostavno vklapljanje oziroma izklapljanje celotnega sistema transkripcije. Prav tako omogoča izražanje gena ne glede na stopnjo razvoja organizma [3].

Cilj

Cilj raziskave je bil, da bi biološko sintetizirali ustrezen transkripcijski faktor, ki bi ga bilo moč uporabiti pri izražanju genov v rastlinah. Najprej so sintetizirali dva zapisa za protein mlcR, vsak pa je pred sabo imel različen lasten operator (en od mlcA in en od mlcC), za sabo pa zapis za GFP, s katerim bi neposredno določili, kateri zapis je imel najmočnejši promotor po vstavljanju in izražanju v Nicotiana benthamiana. Te z najmočnejšimi promotorji so hoteli še izboljšati tako, da so ustvarili več variant sintetičnega transkripcijskega faktorja, kjer je bila spremenjena le aktivatorska domena. Za konec so želeli na transkripcijskem in translacijskem nivoju vstavljenega zapisa določiti, kateri zapis bi najbolj ustrezal za nov sintetični transkripcijski faktor, ki bi deloval kot aktivator transkripcije [1].

Rezultati

Izbira operatorja

V prvem koraku so se lotili izbire operatorjev, pri katerih bodo zaznali največjo aktivnost transkripcije. Sestavili so 8 različnih konstruktov, kjer sta vsakega od dveh transkripcijskih faktorjev (zapis za nativni MlcR in zapis za DNA-vezavno domeno MlcR z eno od sintetiziranih aktivacijskih domen, VP16) povezali s štirimi različnimi operatorji genov mlcA oziroma mlcC, kjer sta se dva enaka zapisa razlikovala po številu njunih ponovitev operatorskih zaporedij (1× mlcA, 4× mlcA, 1× mlcC in 4× mlcC). Vsak konstrukt je za vsemi temi zapisi imel še zapis za protein GFP, ki je služil kot reporterski gen. Sestavili so še 4 kontrolne konstrukte, ki so vsebovali samo reporterski del, se pravi brez dela s transkripcijskim faktorjem. Konstrukte so vstavili v vektor in jih infiltrirali v N. benthamiana. 72 ur pozneje so izmerili fluorescenco, kjer se je izkazalo, da je največji signal v primerjavi z kontrolnimi konstrukti dal konstrukt 4×mclA-VP16, signal je bil dvakrat večji od kontrole. Zato so za nadaljnje poskuse uporabljali operator 4× mclA [1].

Izbira zapisa za aktivacijsko domeno

V naslednji stopnji so želeli ugotoviti, katera aktivacijska domena bi lahko povzročila največjo transkripcijsko aktivnost. Sestavili so 5 konstruktov, kamor so vstavili 5 različnih aktivacijskih domen (VP16, VP64, VP128, TV in QF), za njimi je bil operator 4× mlcA in zapis za GFP. Za vsakega so imeli še kontrolni konstrukt brez zapisa za transkripcijski faktor. Vse te konstrukte so zopet vstavili v vektor in infiltrirali v N. benthamiana. Po istem postopku kot v prejšnjem eksperimentu so tudi tukaj merili fluorescenco in ugotovili, da je največji signal dal konstrukt z aktivacijsko domeno QF, in sicer aktivnost izražanja je bila 6-krat večja v primerjavi z kontrolo [1].

Validacija aktivnosti v transgenski rastlini

Da bi preverili, ali so zasnovani transkripcijski faktorji in promotorji transkripcijsko delujoči tako, kot se biološko pričakuje v rastlinah, so morali preveriti njihovo aktivnost. Pripravili so 29 linij (T0) transgenske rastline Nicotiana tabacum s tremi različnimi vektorskimi konstrukti (4× mlcAVP16, 4× mlcA-QF in 4× mlcA), vsak je imel zapis za odpornost na higromicin (HygR). Vse linije so vzgojili do popolne zrelosti in zbrali njihova semema, da bi zasadili njihove potomce (T1) in z njimi analizirali aktivnost. Ker je reporterski sistem ostal enak, so aktivnost analizirali z merjenjem fluorescence, prav tako pa so določali izražanje gena za GFP, izražanje gena za transkripcijski faktor in izražanje HygR s qRT PCR. Rezultati obeh metod so se ujemali – izkazalo se je, da je najvišja raven izražanja opažena pri liniji s konstruktom 4× mlcA-QF. Linije s konstruktom 4× mlcA-V16 so kljub manjšem izražanju zapisa za GFP imele v primerjavi z 4× mlcA-QF enak nivo izražanja transkripcijskih faktorjev, kar še dodatno okrepi to, da je trankripcijski faktor z aktivacijsko domeno QF zaslužen za povečano transkripcijo. Pri naslednji liniji (T2) je bil nivo izražanja zapisa za GFP še večje. Primerjali so tudi vitalnost transgenske rastline in rastline divjega tipa, pri čemer se je izkazalo, da ni nobenih negativnih fenotipskih učinkov na transgensko rastlino [1].

Zaključek

Glede na to, da v rastlinskih sistemih ne poznamo veliko transkripcijskih faktorjev za aktivacijo transkripcije transgenov v rastlinah, je to področje, na katerem je potrebno narediti še veliko raziskav. Že v tem primeru, ki je opisan v članku, je veliko možnosti za izboljšave, recimo strukturo aktivacijske domene. V tej raziskavi so aktivacijsko domeno povezali z DNA-vezavno domeno z zanko, ki je bila dolga 12 aminokislin s ponovitvami Gly-Ser. Zanimivo bi bilo preštudirati, ali z zamenjavo deležev teh dveh aminokislin ali pa z zamenjavo pozicije teh dveh domen pride do povečanega izražanja genov. Poleg tega bi lahko poskusili v eksperiment uvesti še več različnih konstruktov aktivacijskih domen. Recimo, aktivacijska domena VP16 izhaja iz človeškega virusa, zato bi bilo smiselno optimizirati eksperiment tako, da bi preučili, ali obstaja kakšna aktivacijska domena rastlinskega virusa, ki bi jo lahko vnesli v konstrukt [1]. Primer bi lahko bil gen AL2, ki v virusu mozaika zlatega paradižnika zapisuje za transkripcijski faktor, ki aktivira transkripcijo virusnega proteina ovojnice in gena BR1, ki je odgovoren za utišanje izražanja zapisa za protein ovojnice v tkivu žil rastlin [4]. Poleg tega ne bi rabili optimzirati rabe kodonov, ki je potrebna, ko vključujemo zapise iz drugih organizmov, kar lahko povzroči nestabilnost RNA. Prav tako moramo biti pozorni na dolžino konstrukta, saj lahko predolg vključek zmanjša stabilnost plazmida. Ideja za izboljšavo nivoja izražanja genov je lahko tudi ta, da dodamo še ligand vezavno domeno, ki je pogosto prisotna v sistemih za povišanje izražanja genov. Skratka, na voljo je veliko možnosti izboljšav, ki so vsekakor dobrodošle na tem področju. Z uporabo različnih logičnih vrat bi lahko prišli ne le do aktivatorjev transkripcije v rastlinah, temveč tudi do represorjev in kemijsko inducibilnih sistemov [1].

Viri

[1] A. C. Pfotenhauer idr., „Development of new binary expression systems for plant synthetic biology“, Plant Cell Rep, let. 43, št. 1, str. 22, jan. 2024, doi: 10.1007/s00299-023-03100-y.

[2] R. Chakravarti in V. Sahai, „Compactin - a review“, Appl Microbiol Biotechnol, let. 64, št. 5, str. 618–624, jun. 2004, doi: 10.1007/s00253-003-1553-7.

[3] T. Barwell, B. DeVeale, L. Poirier, J. Zheng, F. Seroude, in L. Seroude, „Regulating the UAS/GAL4 system in adult Drosophila with Tet-off GAL80 transgenes“, PeerJ, let. 5, str. e4167, dec. 2017, doi: 10.7717/peerj.4167.

[4] M. D. Hartitz, G. Sunter, in D. M. Bisaro, „The Tomato Golden Mosaic Virus Transactivator (TrAP) is a Single-Stranded DNA and Zinc-Binding Phosphoprotein with an Acidic Activation Domain“, Virology, let. 263, št. 1, str. 1–14, okt. 1999, doi: 10.1006/viro.1999.9925.