View source for Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3. - 10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan



== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
	
 1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
	
 2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
	
 3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
	
 4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
	
 5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

 - ''P. aeruginosa'' divji tip
	
 - ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2
	
 - ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''
	
 - ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''
	
 - ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
 
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.

Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.

Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.