Reprogramiranje s transpozicijo: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
(New page: ==Uvod== Transpozoni so mobilni genetski elementi, glede na mehanizem transpozicije jih delimo v dve večji skupini: *'''Retrotranspozoni''': mobilnost dosežejo s prepisom v RNA, ki omogo...)
 
 
(5 intermediate revisions by 2 users not shown)
Line 15: Line 15:


==Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev==
==Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev==
Klasične metode, ki se uporabljajo za prepričevanje celic v izražanje tujih genov (npr. mikroinjekcija DNA v notranjost manipulirane celice), se večinoma soočajo z dvema večjima ovirama, ki ju z uporabo transpozona uspešno premagamo: transpozonsko posredovana dostava genov poveča '''učinkovitost integracije''' DNA v kromosome in povzroči '''vključitev »osamljenih« kopij''' namesto konkatemerov (več združenih, v sosledju nanizanih zaporedij, ki jih dostavljamo v celico). Samostojne enote zaporedij so manj podvržene utišanju kot konkatemerni transgeni, ki se pogosto pojavijo ob uporabi klasičnih metod. Poleg tega se lahko pojavijo težave pri prenosu transgena iz klične celične linije(t.j. iz spolne celice) na naslednjo generacijo, kar pogosto povzroči '''transgeno mozaičnost organizmov''' (vse celice organizma, ki se razvije iz oocitov s prehodno injeciranim transgenom, se ne izkažejo pozitivne na transgen- nekatere celice vsebujejo in izražajo vstavljeni gen, druge pa ne). Vzrok tovrstni mozaičnosti je integracija transgena relativno pozno v fazi embrionalnega razvoja, z uporabo transpozona v vlogi vektorja pa lahko integracijo transgena pospešimo: če hkrati s transpozonom, ki smo mu med inverzni 5' ter 3' ponovitvi vstavili željeni gen, injeciramo mRNA, ki kodira transpozazo, zagotovimo hitrejšo dostavo transpozaze in posledično hitrejšo transpozicijo na kromosome tarčnih celic. Eksperimenti potrjujejo, da se s tem poviša odstotek prenosa transgena iz zarodnih celic v naslednjo generacijo, mozaičnost zarodkov pa se znatno zmanjša.
Klasične metode, ki se uporabljajo za prepričevanje celic v izražanje tujih genov (npr. mikroinjekcija DNA v notranjost manipulirane celice), se večinoma soočajo z dvema večjima ovirama, ki ju z uporabo transpozona uspešno premagamo: transpozonsko posredovana dostava genov poveča '''učinkovitost integracije''' DNA v kromosome in povzroči '''vključitev »osamljenih« kopij''' namesto konkatemerov (več združenih, v sosledju nanizanih zaporedij, ki jih dostavljamo v celico). Samostojne enote zaporedij so manj podvržene utišanju kot konkatemerni transgeni, ki se pogosto pojavijo ob uporabi klasičnih metod. Poleg tega se lahko pojavijo težave pri prenosu transgena iz klične celične linije(t.j. iz spolne celice) na naslednjo generacijo, kar pogosto povzroči '''transgeno mozaičnost organizmov''' (vse celice organizma, ki se razvije iz oocita s prehodno injeciranim transgenom, se ne izkažejo pozitivne na transgen- nekatere celice vsebujejo in izražajo vstavljeni gen, druge pa ne). Vzrok tovrstni mozaičnosti je integracija transgena relativno pozno v fazi embrionalnega razvoja, z uporabo transpozona v vlogi vektorja pa lahko integracijo transgena pospešimo: če hkrati s transpozonom, ki smo mu med inverzni 5' ter 3' ponovitvi vstavili željeni gen, injeciramo mRNA, ki kodira transpozazo, zagotovimo hitrejšo dostavo transpozaze in posledično hitrejšo transpozicijo na kromosome tarčnih celic. Eksperimenti potrjujejo, da se s tem poviša odstotek prenosa transgena iz zarodnih celic v naslednjo generacijo, mozaičnost zarodkov pa se znatno zmanjša.




Pogosto je pri eksperimentalnem delu pomembno je tudi, da se v vsako celico vključi zadostno število transpozonov, ki nosijo zapis za gen, ki ga želimo izraziti. To število je zelo majhno, če uporabimo zgolj običajno metodo transfekcije, plazmidi se namreč izjemno na redko integrirajo. Če pa poleg donorskega plazmida (tega, ki nosi željene gene), dodamo še ustrezno količino plazmida, ki kodira transpozazo (pomožni plazmid), se število integracij v celični genom ustrezno zviša- % zvišanja je odvisen od količine obeh dodanih plazmidov. Ta sistem omogoča tudi zelo dober '''nadzor nad številom kopij vstavljenih genov'''.  
Pogosto je pri eksperimentalnem delu pomembno tudi, da se v vsako celico vključi zadostno število transpozonov, ki nosijo zapis za gen, ki ga želimo izraziti. To število je zelo majhno, če uporabimo zgolj običajno metodo transfekcije, plazmidi se namreč izjemno na redko integrirajo. Če pa poleg donorskega plazmida (tega, ki nosi željene gene), dodamo še ustrezno količino plazmida, ki kodira transpozazo (pomožni plazmid), se število integracij v celični genom ustrezno zviša- % zvišanja je odvisen od količine obeh dodanih plazmidov. Ta sistem omogoča tudi zelo dober '''nadzor nad številom kopij vstavljenih genov'''.  
Z eksperimenti so raziskovalci sicer potrdili, da je reprogramiranje učinkovito tudi z insercijo ene same kopije ustrezno sestavljene reprogramacijske kasete (vektorja z geni potrebnimi za reprogramiranje), hkrati pa s tovrstno insercijo '''minimiziramo spremembe na genomu iPS celice'''.
Z eksperimenti so raziskovalci sicer potrdili, da je reprogramiranje učinkovito tudi z insercijo ene same kopije ustrezno sestavljene reprogramacijske kasete (vektorja z geni potrebnimi za reprogramiranje), hkrati pa s tovrstno insercijo '''minimiziramo spremembe na genomu iPS celice'''.


Line 24: Line 24:
Večinoma so celice uspešno reprogramirali z uporabo virusnih vektorjev, ki so omogočili izraženje določenih, za pluripotentne celice značilnih faktorjev. Slabost te metode je veliko število integriranih virusnih vektorjev v induciranih pluripotentnih matičnih celicah. Za reprogramiranje je zelo zaželjena uporaba metode, ki hkrati '''omogoči tudi popolno eliminacijo eksogenih faktorjev''', ki bi se v nasprotnem primeru lahko nenadzorovano reaktivirali in povzročili displazijo, tvorbo tumorjev,... Z uporabo transpozonskega sistema za dostavo željenih genov piggyBac lahko po uspešno izvedenem reprogramiranju transgene ter sam PB zlahka odstranimo iz genoma.  
Večinoma so celice uspešno reprogramirali z uporabo virusnih vektorjev, ki so omogočili izraženje določenih, za pluripotentne celice značilnih faktorjev. Slabost te metode je veliko število integriranih virusnih vektorjev v induciranih pluripotentnih matičnih celicah. Za reprogramiranje je zelo zaželjena uporaba metode, ki hkrati '''omogoči tudi popolno eliminacijo eksogenih faktorjev''', ki bi se v nasprotnem primeru lahko nenadzorovano reaktivirali in povzročili displazijo, tvorbo tumorjev,... Z uporabo transpozonskega sistema za dostavo željenih genov piggyBac lahko po uspešno izvedenem reprogramiranju transgene ter sam PB zlahka odstranimo iz genoma.  


Ena izmed zanesljivih metod za odstranitev reprogramacijskih faktorjev je uporaba Cre rekombinaze. Gen Cre s transfekcijo spravimo v iPS celice, sintetizirana rekombinaza pa nato izreže repogramacijsko kaseto (vektor z geni za reprogramiranje in PB inverznima terminalnima zaporedjema), ki smo jo že na začetku sestavili tako, da vsebuje tudi mesto lox, na katerega Cre lahko deluje. PB transpozon se je pri tem in podobnih eksperimentih izkazal kot popolnoma obvladljiv, saj ga lahko brez kakršnihkoli nastalih sprememb na originalnem celičnem genomu izrežemo. PB transpozonski sistem za dostavo genov omogoča tudi '''indukcijo genetsko nespremenjenih človeških iPS celic''', kar je izjemno izhodišče za napredek regenerativne medicine.
Ena izmed zanesljivih metod za odstranitev reprogramacijskih faktorjev je uporaba Cre rekombinaze. Gen Cre s transfekcijo spravimo v iPS celice, sintetizirana rekombinaza pa nato izreže repogramacijsko kaseto, ki smo jo že na začetku sestavili tako, da vsebuje tudi mesto lox, na katerega Cre lahko deluje. Za izrez genov vstavljenih z uporabo PB transpozonskega sistema opisanega načina ne potrebujemo, kajti za popolno odstranitev ITR in transgenov zadostuje, da v celice prehodno dovedemo ustrezno količino plazmida z zapisom za transpozazo (ta naj bo pod nadzorom ustreznega promotorja). PB transpozon se je pri tem in podobnih eksperimentih izkazal kot popolnoma obvladljiv, saj ga lahko brez kakršnihkoli nastalih sprememb na originalnem celičnem genomu izrežemo z opisanim postopkom. PB transpozonski sistem za dostavo genov torej omogoča '''indukcijo genetsko nespremenjenih človeških iPS celic''', kar je izjemno izhodišče za napredek regenerativne medicine.
 


==Transpozicija in reprogramiranje v praksi==
==Transpozicija in reprogramiranje v praksi==
Line 48: Line 47:


===Dokaz uspešnega reprogramiranja mišjih fibroblastov===
===Dokaz uspešnega reprogramiranja mišjih fibroblastov===
Pluripotentnost s PB reprogramiranih celic je potrdila njihova '''sposobnost razvoja v himerne miške''' (slika 3a). Dokazali so tudi '''prisotnost LacZ gena''' v vseh treh zarodnih plasteh himernih embrijev, kar je dokaz za pluripotentnost s transpozonom obdelanih fibroblastov (slika 3b). Zarodki pridobljeni izključno iz induciranih pluripotentnih matičnih celic so '''vsebovali tkiva vseh treh zarodnih plasti''', razvili so tudi '''spolne (germinalne) celice'''- njihov nastanek v embrijih je potrdila prisotnost Vasa proteina, ki se specifično izraža v liniji germinalnih celic, samo v ovariju in testisih (slika 3c). '''Tvorba teratomov'''- tumorjev, ki vsebujejo celice vseh treh zarodnih plasti- je dodaten dokaz inducirane pluripotentnosti celic; če namreč pluripotentne matične celice vbrizgamo v imunokompromitirane miške, se razvijejo v teratom, kar je dokaz pluripotentnosti s transpozicijo reprogramiranih fibroblastov.  
Pluripotentnost s PB reprogramiranih celic je potrdila njihova '''sposobnost razvoja v himerne miške''', zatem ko so jih vbrizgali v blastociste (slika 3a). Dokazali so tudi '''prisotnost LacZ gena''' v vseh treh zarodnih plasteh himernih embrijev, kar je dokaz za pluripotentnost s transpozonom obdelanih fibroblastov (slika 3b). Zarodki pridobljeni izključno iz induciranih pluripotentnih matičnih celic so '''vsebovali tkiva vseh treh zarodnih plasti''', razvili so tudi '''spolne (germinalne) celice'''- njihov nastanek v embrijih je potrdila prisotnost Vasa proteina, ki se specifično izraža v liniji germinalnih celic, samo v ovariju in testisih (slika 3c). '''Tvorba teratomov'''- tumorjev, ki vsebujejo celice vseh treh zarodnih plasti- je dodaten dokaz inducirane pluripotentnosti celic; če namreč pluripotentne matične celice vbrizgamo v imunokompromitirane miške, se razvijejo v teratom, kar je dokaz pluripotentnosti s transpozicijo reprogramiranih fibroblastov.  


Dejstvo, da so se bile iz iPS celic sposobne razviti žive himerne miške (slika 3d), potrjuje popolno reprogramiranje fibroblastov z uporabo PB-transpozonskega sistema, ki je sposoben zagotoviti razvoj specializiranih celic, ki tvorijo funkcionalna tkiva.
Dejstvo, da so se bile iz iPS celic sposobne razviti žive himerne miške (slika 3d), potrjuje popolno reprogramiranje fibroblastov z uporabo PB-transpozonskega sistema, ki je sposoben zagotoviti razvoj specializiranih celic, ki tvorijo funkcionalna tkiva.
Line 54: Line 53:


Povezava do slik: http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html
Povezava do slik: http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html


==Reprogramiranje človeških fibroblastov==
==Reprogramiranje človeških fibroblastov==
Line 61: Line 59:


==Reprogramiranje sekundarnih fibroblastov==
==Reprogramiranje sekundarnih fibroblastov==
Iz diploidnih himernih (himera – organizem, ki je sestavljen iz celic dveh ali več genetsko različnih osebkov, v tem primeru mišk) induciranih pluripotentnih celičnih linij so pridobili sekundarne fibroblaste in jih poskušali reprogramirati na enak način kot primarne. Rezultati so pokazali hitrejše odzivanje le-teh na faktorje in doksiciklin v mediju, npr. test na alkalno fosfatazo je bil pozitiven že drugi dan inkubacije. Tako hiter odziv morda kaže na določeno mero nestabilnosti tovrstnega načina reprogramiranja.
Iz diploidnih himernih (himera – organizem, ki je sestavljen iz celic dveh ali več genetsko različnih osebkov, v tem primeru mišk) induciranih pluripotentnih celičnih linij so pridobili sekundarne fibroblaste in jih poskušali reprogramirati na enak način kot primarne. Od treh celičnih linij fibroblastov, katere so poskusili ponovno preobraziti v pluripotentne, se je ena slabo odzvala na poskus indukcije, drugi dve pa dobro.
 
Rezultati so pokazali hitro odzivanje le-teh na faktorje in doksiciklin v mediju, veliko hitrejše kot pri poskusih, ki so za indukcijo uporabili lentivirusne sisteme. Test na alkalno fosfatazo je bil pozitiven že drugi dan inkubacije, celice so se tudi intenzivneje delile in 29% posameznih celic je bilo sposobnih tvoriti kolonije.


==Zaključek==
==Zaključek==
Line 74: Line 72:




==Prilagoditev PB za delo z sesalskimi celicami==
==Prilagoditev PB za delo s sesalskimi celicami==
PiggyBac je do nedavnega veljal za uporabnega samo za delo z določenimi rodovi insektov, šele pred kratkim so ga prilagodili za tranpozicijo v sesalskih celicah, natančneje mišjih.  
PiggyBac je do nedavnega veljal za uporabnega samo za delo z določenimi rodovi insektov, šele pred kratkim so ga prilagodili za tranpozicijo v sesalskih celicah, natančneje mišjih.  
Pri rekonstrukciji PB za mišje celice je bilo potrebno prilagoditi več lastnosti transpozona: sam genetski zapis za transpozazo, terminalna zaporedja in poskrbeti za nadzor nad frekvenco transpozicije.  
Pri rekonstrukciji PB za mišje celice je bilo potrebno prilagoditi več lastnosti transpozona: sam genetski zapis za transpozazo, terminalna zaporedja in poskrbeti za nadzor nad frekvenco transpozicije.  
Najprej so optimizirali nukleotidno zaporedje za PB transpozazo, da je vsebovalo tiste kodone, ki jih pri translaciji preferira mišja celica. S tem so dosegli večjo ekspresijo transpozaze in tako tudi večjo pogostost transpozicije.
Najprej so optimizirali nukleotidno zaporedje za PB transpozazo, da je vsebovalo tiste kodone, ki jih pri translaciji preferira mišja celica. S tem so dosegli večjo ekspresijo transpozaze in tako tudi večjo pogostost transpozicije.
Frekvenco transpozicije so poskušali povečati tudi s spreminjanjem terminalnih zaporedij PB transpozona. Zanj je značilno 13 bp dolgo obrnjeno zapoedje na obeh straneh in še dodatna 19 bp dolga obrnjena zaporedja, ki pa so razporejena asimetrično. Eksperiment je pokazal, da je originalna oblika najprimernejša tudi za transpozicijo v mišjih celicah.
Frekvenco transpozicije so poskušali povečati tudi s spreminjanjem terminalnih zaporedij PB transpozona. Zanj je značilno 13 bp dolgo obrnjeno zapoedje na obeh straneh in še dodatna 19 bp dolga obrnjena zaporedja, ki pa so razporejena asimetrično. Eksperiment je pokazal, da je originalna oblika najprimernejša tudi za transpozicijo v mišjih celicah.
Potrebno pa je bilo še poskrbeti za nadzor nad transpozicijo. Zato so na PB transpozon vstavili še gen za ERT2 in tako naredili fuzijski protein  PB transpozaze in ERT2. ERT2 je modificirana domena receptorja za estrogen, ki veže ligand in omogoča regulacijo aktivnosti proteina z molekulo 4-hidroksitamoksifen (4-OHT).  
Potrebno pa je bilo še poskrbeti za nadzor nad transpozicijo. Zato so na PB transpozon vstavili še gen za ERT2 in tako naredili fuzijski protein  PB transpozaze in ERT2. ERT2 je modificirana domena receptorja za estrogen, ki veže ligand in omogoča regulacijo aktivnosti proteina z molekulo 4-hidroksitamoksifen (4-OHT).
 


==Viri==
==Viri==

Latest revision as of 18:20, 4 June 2013

Uvod

Transpozoni so mobilni genetski elementi, glede na mehanizem transpozicije jih delimo v dve večji skupini:

  • Retrotranspozoni: mobilnost dosežejo s prepisom v RNA, ki omogoči integracijo prepisane DNA na drugo mesto v genomu.
  • DNA transpozoni: uporabljajo mehanizem »izreži – prilepi«, pri katerem ne pride do prepisa v RNA, zato je tudi zgradba tovrstnega transpozona drugačna od zgradbe retrotranspozona: zapis za protein transpozazo je na obeh koncih obdan z inverznima ponovitvama, ki služita kot vezavni mesti za transpozazo. Slednja izreže element in ga prenese na novo mesto v DNA. Ta proces lahko nadzorujemo z ločitvijo zapisa za transpozazo- namesto katerega lahko vključimo kako drugo (željeno) zaporedje DNA, ki se bo v procesu preneslo- od končnih inverznih ponovitev (ITR- inverted terminal repeats), s čimer ustvarimo neavtonomni element. Ta se lahko prenese le, če zagotovimo dodatni vir proteina transpozaze. Tak dvokomponentni sistem se je med drugim izkazal kot zelo uporaben tudi za reprogramiranje somatskih celic.


Transpozoni kot orodje za vstavljanje genov

Osnovni kriteriji, ki jih moramo upoštevati pri izbiranju DNA transpozona in konstruiranju transgenov za manipulacijo celic in organizmov, so:

  • ustrezna stopnja aktivnosti transpozona v izbrani vrsti,
  • izogib mobilizaciji transpozonov, ki so naravno prisotni v tarčnem genomu,
  • kapaciteta transpozona- transgeni konstrukti pogosto presežejo velikost večih kilobaznih parov, saj poleg željenih kodirajočih regij največkrat vključujejo tudi transkripcijske regulatorne elemente. Kapacitete različnih DNA transpozonov se med seboj močno razlikujejo, piggyBac in Tol2 skupini transpozonov sta se do zdaj izkazali za najbolj kapacitivni. To raziskovalcem omogoča vključitev kompleksnih transgenov med inverzni ponovitvi, pri čemer ne trpi učinkovitost transpozicije.
  • Priljubljeno mesto integracije- večina transpozonov ima za tarčo neko specifično zaporedje DNA, dolgo nekaj baznih parov, za katerim se lahko »prilepi«. Tarča piggyBac transpozona so TTAA zaporedja, izraža tudi preferenco do integracije v bižino mest začetka transkripcije in v introne znotraj genov. DNA transpozoni iz družine Tc1/mariner se vključujejo za dinukleotidi TA; najbolj preučen pripadnik te družine je transpozon Sleeping Beauty, zanj je značilna integracija znotraj palindromskih AT ponovitev. Nekateri transpozoni nimajo priljubljenih integracijskih mest, temveč se navidez naključno vključujejo v gostiteljski genom; tak primer so Tol2 DNA transpozoni in dobro raziskani retrotranspozoni L1.
  • »Lokalno hopsanje«-(lokalno skakanje)- izraz opisuje fenomen transpozicije na kromosomu; zanjo je značilno, da se veliko pogosteje pojavlja na cis-mestih v bližini donorskega lokusa: transpozon se izreže iz donorskega mesta na kromosomu in se prilepi nekam v bližino, najpogosteje pristane znotraj iste verige DNA glede na donorsko mesto. Lokalno hopsanje omeji dostopna mesta za transpozon, saj le-ta, razen izjemoma, ne more skočiti izven določene kromosomske regije, kar je uporabno pri povzročanju nasičenja z mutacijami znotraj omejenih kromosomskih regij in s tem ugotavljanja lokacij genov ter njihovih funkcij. Za oba, PiggyBac (PB) in Sleeping Beauty (SB), je značilno lokalno hopsanje, toda pri PB lahko opazimo bolj naključen integracijski vzorec kot pri SB; to je eden izmed primerov, ki dokazujejo specifičnost vzorca poskakovanja za posamezen tip transpozona. Ta vzorec je različen tudi pri različnih vrstah organizmov in je celo odvisen od donorskega lokusa transpozona na kromosomu. Pri retrotranspozonih ni opaziti težnje po lokalnem hopsanju, kar je najverjetneje povezano z njihovim »življenjskim ciklom«, ki se povsem razlikuje od cikla DNA transpozonov. Le-ti po izrezu ostanejo v jedru, RNA molekula pa, ki je nastala s prepisom retrotranspozona, mora najprej priti v citoplazmo, kjer se prevede v potrebne proteine, ki nato izvršijo transpozicijo, slednja je zato povsem neodvisna od donorskega mesta.


Prednosti uporabe transpozonov v vlogi vektorjev

Klasične metode, ki se uporabljajo za prepričevanje celic v izražanje tujih genov (npr. mikroinjekcija DNA v notranjost manipulirane celice), se večinoma soočajo z dvema večjima ovirama, ki ju z uporabo transpozona uspešno premagamo: transpozonsko posredovana dostava genov poveča učinkovitost integracije DNA v kromosome in povzroči vključitev »osamljenih« kopij namesto konkatemerov (več združenih, v sosledju nanizanih zaporedij, ki jih dostavljamo v celico). Samostojne enote zaporedij so manj podvržene utišanju kot konkatemerni transgeni, ki se pogosto pojavijo ob uporabi klasičnih metod. Poleg tega se lahko pojavijo težave pri prenosu transgena iz klične celične linije(t.j. iz spolne celice) na naslednjo generacijo, kar pogosto povzroči transgeno mozaičnost organizmov (vse celice organizma, ki se razvije iz oocita s prehodno injeciranim transgenom, se ne izkažejo pozitivne na transgen- nekatere celice vsebujejo in izražajo vstavljeni gen, druge pa ne). Vzrok tovrstni mozaičnosti je integracija transgena relativno pozno v fazi embrionalnega razvoja, z uporabo transpozona v vlogi vektorja pa lahko integracijo transgena pospešimo: če hkrati s transpozonom, ki smo mu med inverzni 5' ter 3' ponovitvi vstavili željeni gen, injeciramo mRNA, ki kodira transpozazo, zagotovimo hitrejšo dostavo transpozaze in posledično hitrejšo transpozicijo na kromosome tarčnih celic. Eksperimenti potrjujejo, da se s tem poviša odstotek prenosa transgena iz zarodnih celic v naslednjo generacijo, mozaičnost zarodkov pa se znatno zmanjša.


Pogosto je pri eksperimentalnem delu pomembno tudi, da se v vsako celico vključi zadostno število transpozonov, ki nosijo zapis za gen, ki ga želimo izraziti. To število je zelo majhno, če uporabimo zgolj običajno metodo transfekcije, plazmidi se namreč izjemno na redko integrirajo. Če pa poleg donorskega plazmida (tega, ki nosi željene gene), dodamo še ustrezno količino plazmida, ki kodira transpozazo (pomožni plazmid), se število integracij v celični genom ustrezno zviša- % zvišanja je odvisen od količine obeh dodanih plazmidov. Ta sistem omogoča tudi zelo dober nadzor nad številom kopij vstavljenih genov. Z eksperimenti so raziskovalci sicer potrdili, da je reprogramiranje učinkovito tudi z insercijo ene same kopije ustrezno sestavljene reprogramacijske kasete (vektorja z geni potrebnimi za reprogramiranje), hkrati pa s tovrstno insercijo minimiziramo spremembe na genomu iPS celice.


Večinoma so celice uspešno reprogramirali z uporabo virusnih vektorjev, ki so omogočili izraženje določenih, za pluripotentne celice značilnih faktorjev. Slabost te metode je veliko število integriranih virusnih vektorjev v induciranih pluripotentnih matičnih celicah. Za reprogramiranje je zelo zaželjena uporaba metode, ki hkrati omogoči tudi popolno eliminacijo eksogenih faktorjev, ki bi se v nasprotnem primeru lahko nenadzorovano reaktivirali in povzročili displazijo, tvorbo tumorjev,... Z uporabo transpozonskega sistema za dostavo željenih genov piggyBac lahko po uspešno izvedenem reprogramiranju transgene ter sam PB zlahka odstranimo iz genoma.

Ena izmed zanesljivih metod za odstranitev reprogramacijskih faktorjev je uporaba Cre rekombinaze. Gen Cre s transfekcijo spravimo v iPS celice, sintetizirana rekombinaza pa nato izreže repogramacijsko kaseto, ki smo jo že na začetku sestavili tako, da vsebuje tudi mesto lox, na katerega Cre lahko deluje. Za izrez genov vstavljenih z uporabo PB transpozonskega sistema opisanega načina ne potrebujemo, kajti za popolno odstranitev ITR in transgenov zadostuje, da v celice prehodno dovedemo ustrezno količino plazmida z zapisom za transpozazo (ta naj bo pod nadzorom ustreznega promotorja). PB transpozon se je pri tem in podobnih eksperimentih izkazal kot popolnoma obvladljiv, saj ga lahko brez kakršnihkoli nastalih sprememb na originalnem celičnem genomu izrežemo z opisanim postopkom. PB transpozonski sistem za dostavo genov torej omogoča indukcijo genetsko nespremenjenih človeških iPS celic, kar je izjemno izhodišče za napredek regenerativne medicine.

Transpozicija in reprogramiranje v praksi

Ekspresija štirih transkripcijskih faktorjev (c-Myc, Klf4, Oct4 in Sox2; MKOS) zadostuje za uspešno reprogramiranje somatskih celic v pluripotentne matične (iPS celice). Le-te so po lastnostih in potencialu za diferenciacijo v odrasle tipe celic podobne embrionalnim matičnim celicam (ES). Obetavna in učinkovita strategija reprogramiranja je uporaba PB transpozon/transpozaza sistema, ki je neodvisen od vrste gostitelja oz. tipa celic, zahteva zgolj konstrukcijo plazmida s transgeni, obdanimi z inverznimi terminalnimi zaporedji, in prehodno ekspresijo encima transpozaze, ki katalizira insercijo-pa tudi izrez- plazmidnega konstrukta. Woltjen in sod. so opisali uspešno reprogramiranje mišjih in človeških embrionalnih fibroblastov z uporabo doksiciklina, ki je omogočil indukcijo transkripcijskih faktorjev MKOS, v celice dovedenih s PB transpozonskim sistemom. Stabilne iPS so izražale karakteristične markerje pluripotentnosti in so se bile sposobne diferencirati v kompleksna funkcionalna tkiva. Dokazali so tudi, da je posamezne integracije PB možno brez morbidnih preostalih sledi odstraniti iz iPS celic.


Iniciacija reprogramiranja

Gene MKOS so vključili v PB-TET transpozonski plazmid (PB-TET-mFx, slika 1a), katerega transkripcija je bila pod nadzorom tetraciklina/doksiciklina; katerikoli izmed obeh antibiotikov je lahko z vplivanjem na promotor povzročil indukcijo transgenov MKOS, intenzivnost izražanja je bila s tem odvisna od koncentracije tet./doks., ki jo je v laboratoriju enostavno regulirati. Promotor in MKOS so bili povezani z βgeo (fuzija β-galaktozidaznega gena in gena za odpornost proti neomicinu) preko IRES sekvence, da so lahko zasledovali kako uspešno oz. tesno doksiciklin regulira izražanje transgenov in kasneje ugotavljali sposobnost celic za vzdrževanje pluripotentnosti kljub odtegnitvi eksogenih faktorjev. Mišje embrionalne fibroblaste, ki so vsebovali odzivni protein za doksiciklin, so podvrgli transfekciji s krožnim plazmidnim konstruktom PB-TET-mFx in pomožnim plazmidom z zapisom za PB transpozazo. Celice so gojili v mediju primernem za ES celične kulture, ki je vseboval doksiciklin in v kratkem so fibroblasti začeli tvoriti ES celičnim kolonijam podobne strukture.


Vzpostavitev in potrditev pluripotentnosti

Opisanemu je sledil nastanek celičnih linij, ki so imele sposobnost samoobnavljanja in so izražale ključne lastnosti reprogramiranih celic. Število kolonij reprogramiranih celic se je razlikovalo pri različnih koncentracijah doksiciklina- nad standardno koncentracijo (1,5μg/ml) je bilo kolonij znatno več, pod standardno pa drastično manj. Tak rezultat potrjuje, da stopnja izražanja štirih faktorjev določa učinkovitost reprogramacije. V ekstremnem primeru, ko raziskovalci v gojišče doksiciklina niso dodali, se nobena celica ni reprogramirala, kajti transgeni se niso mogli izraziti. V treh tednih gojenja je večina celic (89%) postala neodvisnih od prisotnosti doksiciklina; celice so bile sposobne avtonomno vzdrževati reprogramirano stanje.


Če je na opisan način doseženo reprogramirano stanje stabilno, bi se v nekaj tednih morali v celicah postopno pojaviti značilni markerji (sicer naravno prisotni v embrionalnih izvornih celicah); testi so potrdili prisotnost naslednjih (slika 1b): stabilne celice so aktivirale alkalno fosfatazo, SSEA1 je bil prisoten na njihovi površini, Nanog protein (transkripcijski faktor s poglavitno funkcijo vzdrževanja matičnosti celic) je bil prisoten v jedru; aktivni so bili tudi markerji pluripotentnosti Dax1, Eras, Fbxo, Foxd3, Rex1 in Zfp296; v večini celic so bili prisotni tudi proteinski produkti štirih dovedenih transgenov. Z uporabo RT-PCR in preko aktivnosti LacZ (vključen v βgeo reporterski gen na plazmidu) so določili stopnjo izražanja posameznih transgenov v prisotnosti in odsotnosti doksiciklina; po pričakovanju je bilo izražanje (obarvanje) veliko bolj intenzivno v prisotnosti antibiotika (slika 1d). Z metodo so detektirali povprečne aktivnosti transgenov MKOS v posameznih reprogramiranih celičnih populacijah, niso pa zaznali mozaičnih vzorcev izražanja (mozaicizma celic- npr. nekatere celice so izražale minimalno ali celo nič c-Myc, druge celice so ga izražale več). Povprečno ugotovljeno število integracij PB transpozona (število kopij) je bilo 9 na celico.


Odstranitev transgenov in celično samoohranjanje pluripotentnosti

Da bi odstranili transgene iz genoma po uspešnem reprogramiranju, so raziskovalci v celice prehodno dodali večjo količino transpozaze. Pogostost izreza se je pri različnih klonih celic zelo razlikovala, kar nakazuje, da je uspešnost izreza transpozona odvisna od mesta njegove integracije. Z nekaj dodatnimi postopki je raziskovalcem uspelo izolirati 10 kolonij, v katerih ni bilo prisotne nikakršne sledi integracije transpozona. Kljub tovrstni odstranitvi prvotno vstavljenih transgenov, so celice avtonomno izražale gene potrebne za pluripotentnost.


Dokaz uspešnega reprogramiranja mišjih fibroblastov

Pluripotentnost s PB reprogramiranih celic je potrdila njihova sposobnost razvoja v himerne miške, zatem ko so jih vbrizgali v blastociste (slika 3a). Dokazali so tudi prisotnost LacZ gena v vseh treh zarodnih plasteh himernih embrijev, kar je dokaz za pluripotentnost s transpozonom obdelanih fibroblastov (slika 3b). Zarodki pridobljeni izključno iz induciranih pluripotentnih matičnih celic so vsebovali tkiva vseh treh zarodnih plasti, razvili so tudi spolne (germinalne) celice- njihov nastanek v embrijih je potrdila prisotnost Vasa proteina, ki se specifično izraža v liniji germinalnih celic, samo v ovariju in testisih (slika 3c). Tvorba teratomov- tumorjev, ki vsebujejo celice vseh treh zarodnih plasti- je dodaten dokaz inducirane pluripotentnosti celic; če namreč pluripotentne matične celice vbrizgamo v imunokompromitirane miške, se razvijejo v teratom, kar je dokaz pluripotentnosti s transpozicijo reprogramiranih fibroblastov.

Dejstvo, da so se bile iz iPS celic sposobne razviti žive himerne miške (slika 3d), potrjuje popolno reprogramiranje fibroblastov z uporabo PB-transpozonskega sistema, ki je sposoben zagotoviti razvoj specializiranih celic, ki tvorijo funkcionalna tkiva.


Povezava do slik: http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07863.html

Reprogramiranje človeških fibroblastov

Transpozon PB-CAG-rtTA skupaj s PB-TET-mFx za regulacijo reprogramiranja z doksiciklinom so uspešno uporabili tudi za reprogramiranje človeških embrionalnih fibroblastov. Kolonije induciranih pluripotentnih celic so izbrali med 14 in 28 dnevi starosti. Štiri od petih, ki so dale pozitiven test na alkalno fosfatazo (markerski encim za pluripotentne celice), so po enem tednu postale neodvisne od doksiciklina, torej so ostale pluripotentne tudi po odstranitvi le-tega iz medija. Ekspresija genov za transkripcijske faktorje in markerskih genov za pluripotenco je dosegla tako visoke ravni kot v embrionalnih matičnih celicah. Po odstranitvi bFGF-ja (basic fibroblast growth factor) je v kolonijah prišlo do tvorbe cističnih embrioidnih telesc (skupkov pluripotentnih celic) in do spontane diferenciacije v endodermalne, ektodermalne in mezodermalne celice. Kot kaže, se torej mišje transkripcijske faktorje da uporabiti tudi za reprogramiranje človeških celic.


Reprogramiranje sekundarnih fibroblastov

Iz diploidnih himernih (himera – organizem, ki je sestavljen iz celic dveh ali več genetsko različnih osebkov, v tem primeru mišk) induciranih pluripotentnih celičnih linij so pridobili sekundarne fibroblaste in jih poskušali reprogramirati na enak način kot primarne. Od treh celičnih linij fibroblastov, katere so poskusili ponovno preobraziti v pluripotentne, se je ena slabo odzvala na poskus indukcije, drugi dve pa dobro. Rezultati so pokazali hitro odzivanje le-teh na faktorje in doksiciklin v mediju, veliko hitrejše kot pri poskusih, ki so za indukcijo uporabili lentivirusne sisteme. Test na alkalno fosfatazo je bil pozitiven že drugi dan inkubacije, celice so se tudi intenzivneje delile in 29% posameznih celic je bilo sposobnih tvoriti kolonije.

Zaključek

Na splošno se je reprogramiranje s transpozoni izkazalo za uspešno, ima veliko prednosti in pomeni znaten napredek za transfekcijske tehnike vstavljanja genov, in potencialen način za pridobivanje IPC v prihodnosti. Kot prvo omogoča tehnično enostaven in bolj cenovno dostopen način reprogramiranja, saj potrebujemo le plazmidno DNA in komercialne pripomočke za transfekcijo. Ker ne piotrebujemo virusov, ki lahko napadejo samo določene tipe celic, se poveča tudi rang somatskih celic, ki jih lahko uporabimo za indukcijo. Vstavljanje genov s PB-transpozonom tudi omogoča produkcijo induciranih pluripotentnih celic, ki ne vsebujejo ksenobiotikov (substance, ki jih organizem sam ne proizvaja, a so v njem prisotne). In ko celice reprogramiramo lahko z aktivacijo transpozaze tudi odstranimo transpozon. Poleg samega reprogramiranja celic, ki ima velik potencial v regenerativni medicini, je transpozicija uporabna za preučevanje funkcije genov, lahko bi bila uporabna tudi pri genski terapiji in preprečevanju rasti tumoerjev.


PiggyBac transpozon

Prvič so ga našli v mutiranih baculovirusih, ki so okužili celice TN-368 (izvirajo iz vešče vrste Trichoplusia ni). V nekaterih mutantih so opazili del gostiteljske DNA, za katero se je izkazalo, da gre za transpozon. Ime izvira iz besede piggybacking, izraza, ki pomeni prenašanje čkoveka na hrbtu, s tem da skovanka vsebuje velik B in je brez k-ja, kar označuje povezanost z baculovirusi. Najprej je PB transpozon dobil nezveneče ime IFP2, kasneje pa ga je njegov odkritelj, Malcom J. Fraser, spremenil v piggyBac, da bi tako pritegnil več pozornosti.


Prilagoditev PB za delo s sesalskimi celicami

PiggyBac je do nedavnega veljal za uporabnega samo za delo z določenimi rodovi insektov, šele pred kratkim so ga prilagodili za tranpozicijo v sesalskih celicah, natančneje mišjih. Pri rekonstrukciji PB za mišje celice je bilo potrebno prilagoditi več lastnosti transpozona: sam genetski zapis za transpozazo, terminalna zaporedja in poskrbeti za nadzor nad frekvenco transpozicije. Najprej so optimizirali nukleotidno zaporedje za PB transpozazo, da je vsebovalo tiste kodone, ki jih pri translaciji preferira mišja celica. S tem so dosegli večjo ekspresijo transpozaze in tako tudi večjo pogostost transpozicije. Frekvenco transpozicije so poskušali povečati tudi s spreminjanjem terminalnih zaporedij PB transpozona. Zanj je značilno 13 bp dolgo obrnjeno zapoedje na obeh straneh in še dodatna 19 bp dolga obrnjena zaporedja, ki pa so razporejena asimetrično. Eksperiment je pokazal, da je originalna oblika najprimernejša tudi za transpozicijo v mišjih celicah. Potrebno pa je bilo še poskrbeti za nadzor nad transpozicijo. Zato so na PB transpozon vstavili še gen za ERT2 in tako naredili fuzijski protein PB transpozaze in ERT2. ERT2 je modificirana domena receptorja za estrogen, ki veže ligand in omogoča regulacijo aktivnosti proteina z molekulo 4-hidroksitamoksifen (4-OHT).

Viri

  • Woltjen, K. in sod. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, vol. 458, str. 766-770.
  • Kaji, K. in sod. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature, 2009, vol. 458, str. 771-775.
  • Ivics, Z. in sod. Transposon-mediated Genome Manipulations in Vertebrates. Nat Methods, 2009, štev. 6, str. 415-422.
  • Cadiñanos, J.; Bradley, A. Generation of an inducible and optimized piggyBac transposon system. Nuclei Acids Research, 2007, vol.35(12), e87
  • piggyBac [online] [citirano 24.5.2013 ob 17:40] Dostopno na spletnem naslovu: http://piggybac.bio.nd.edu /