View source for Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x#MOESM1 Wang X., Han J. N., Zhang X., Ma Y. Y., Lin Y., Wang H., Li D. J., Zheng T. R., Wu F. Q., Ye J. W., in Chen G. Q.: Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), str. 1-13]

== '''Uvod''' ==
Primarni cilj metabolnega inženirstva je čim bolj povečati produkcijo želene molekule/spojine. Da to dosežemo, moramo čim bolj optimizirati metabolne poti, kar včasih zaradi njihove kompleksnosti postane precej zahtevno. V statičnih sistemih je običajno težko dobiti visoke izkoristke produkta, zato v določenih primerih v uporabo vedno pogosteje prihajajo dinamično regulirani sistemi, ki na nek način oponašajo tvorbo neke spojine, kakor se sicer dogaja v živih organizmih [3]. V sintezni biologiji se vedno bolj uveljavljajo genetsko programirana vezja, ki omogočajo bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije, saj lahko prinesejo velike izboljšave za industrijske namene. Kljub temu razvoj tovrstnih vezij in pripadajočih stikal zaenkrat predstavlja še velik izziv v metabolnem inženirstvu, predvsem zaradi pomanjkanja robustnosti. V nadaljevanju bom na kratko predstavila robustno termosenzibilno stikalo, ki omogoča dokaj natančen dvosmerni nadzor ekspresije genov v živih celicah. Le-ta omogoča sočasno aktivacijo in zaustavitev ali zmanjšanje izražanja dveh različnih setov genov, kar lahko nadziramo in uravnavamo s spremembo temperature [6]. 

== '''T-stikalo''' ==
Avtorji izhodiščnega članka so termosenzibilno stikalo poimenovali »T-switch«. Omogoča bifunkcionalno dinamično uravnavanje ekspresije genov v rekombinantni Escerichii coli, temelji pa na temperaturno odvisnem transkripcijskem regulatorju CI857. Gre za mutiran represorski protein CI bakteriofaga λ. Pri 30°C je represor v nativnem stanju, ko pa temperaturo zvišamo na 42°C, se denaturira in tako se promotor lahko aktivira [1]. Pri T-stikalu je situacija podobna, le da se izražanje določenih proteinov spremeni pri spremembi temperature iz 30°C  na 37°C . S pomočjo T-stikala je raziskovalni skupini uspelo tvoriti bakterijske kolonije z vzorcem, ki spominja na vzorec drevesnih letnic, ki jih lahko vidimo ob prerezu debla. Tak vzorec jim je uspelo pridobiti s periodičnim spreminjanjem temperature med 30°C in 37°C, pri čemer sta se izmenjaje izražala rdeči (mRFP) in zeleni fluorescenčni protein (sfGFP). V naslednjem koraku jim na enak način uspelo »prisiliti« bakterije, da so spreminjale svojo obliko v odvisnosti od temperature, le da so v tem primeru uravnavali ekspresijo genov, ki so povezani z morfološkimi lastnostmi celic. V zadnjem poskusu so s pomočjo T-stikala povezali biosintezo uporabili za sintezo dveh polihidroksi alkanoatov (PHA), s čimer so pokazali, da lahko s tem sistemom precizno uravnavamo izražanje želenih genov, kar pa lahko prenesemo tudi na višjo skalo [6].

===Delovanje T-stikala===
Genetsko vezje je osnovano na logičnih vratih NE, omogoča pa bifunkcionalno izražanje genov. Vstopni signal predstavlja represor PhIF, ki je povezan s temperaturno odvisnim represorejm  cI857. Izhodna signala sta dva: reporterski protein sfGFP (ang. superfolder green fluorescent protein), ki se izraža pod kontrolo promotorja PPhIF, ter reporterski protein mRFP (ang. monomeric red fluorescent protein), ki je postavljen genom phIF. Ko bakterije gojimo pri 30°C, se izraža zeleni fluorescenčni protein in je izražanje rdečega fluorescenčnega proteina »ugasnjeno«, ko pa jih gojimo pri temperaturi 37°C, se zgodi ravno obratno – izraža se rdeči fluorescenčni protein [6].

== '''Rezultati''' ==
===Izdelava prototipa===
Sev E. coli, na katerem so delali, je JM109SGL, ki je sicer prilagojen za sintezo PHA, saj vsebuje mutacijo v genih sad in gabD (sinteza poteka v smer PHB) [4] ter delecijo lacI. Za modul, ki zaznava temperaturo in je nanjo občutljiv, so uporabili izražanje represorskega proteina cI857, ki pri 30°C zavira promotor PR tako, da tvori dimerni kompleks in na ta način lahko regulira transkripcijo represorja PhIF in reporterja mRFP pri temperaturi 30°C in 37°C. Ta konstrukt so označili s številko 165. Drugi konstrukt (155) je vseboval reporterski protein sfGFP, ki je pod kontrolo promotorja PPhIF, le-tega pa inhibira PhIF. Signal za transkripcijo sfGFP ali »mirovanje« je zopet sprememba temperature. S t.i. dvosmernim nadzorom lahko torej obravnavamo ON/OFF izražanje reporterskih proteinov sfGFP in mRFP. Da so preverili delovanje vezja, so z obema konstruktoma skupaj (155+165) transficirali kompetentne celice E. coli in jih pustili rasti v LB gojišču 12 ur pri različnih temperaturah. Medtem so spremljali fluorescenco pri temperaturi med 30°C in 37°C. Le-ta se je spreminjala v skladu s pričakovanji (pri temperaturi 30°C je prevladovalo izražanje sfGFP, pri temperaturi 37°C pa izražanje mRFP) [6].

== '''Optimizacija in lastnosti T-stikala''' ==
Prvotni strukturi T-stikala, ki ga sestavljata zgoraj omenjena konstrukta 155 in 165, so dodali še kontrolo z negativno povratno zanko na temperaturno-senzorni panel. V vezje so vnesli represor LacI, ki ga kodira gen lacI in je pod kontrolo promotorja PPhIF. Gen lacI so torej izrazili s sfgfp, s čimer so dosegli strogo zaviranje promotorske aktivnosti promotorja PR, pod katerega so vnesli zapis za operator LacO. Vse skupaj se je odražalo v izražanju sfGFP. Z negativno povratno zanko so dosegli bolj precizno izražanje obeh reporterskih proteinov v primerjavi s prvotnim konstruktom [6].

===Tvorba obročastih vzorcev kot odziv na spremembo temperature===
Genetska vezja lahko izkoriščamo tudi za imitacijo vzorcev, ki se pojavljajo v naravi. Raziskovalna skupina je z namenom prikaza uporabnosti T-stikala testirala odziv sistema na periodično spreminjanje temperature in bifunkcijski nadzor med tvorbo kolonij. Pri tem so imitirali tvorbo obročev, ki nastanejo pri drevesih zaradi vpliva temperature in vlažnosti v posameznem letnem času, vidimo pa jih lahko na prerezu debla. Kolonije rekombinantnih celic so se pod vplivom temperature uredile v porazdeljene obroče zelene barve, ki predstavlja sfGFP, in rdeče barve, ki predstavlja mRFP. Poskus so izvajali 3 dni tako, da so celice gojili po 10 ur pri 37°C in po 14 ur pri 30°C. Kolonije so se torej pri 37°C obarvale rdeče, pri 30°C pa zeleno. Zanimivo je, da se je čisto prva kolonija, ki je bila sprva rdeča, ob pojavu zelene kolonije obarvala rumeno, kar nakazuje na združevanje zelene in rdeče barve. Zeleni obročki so bili bolj razločni, rdeči pa so bili proti zunanjosti manj intenzivni, ker je bila in sito spominska ekspresija mRFP periodično aktivirana, ko je bila kolonija izpostavljena temperaturi 37°C. Če bi želeli dobiti razločne in enako intenzivne rdeče obročke, bi moral biti izklop (stanje OFF) enakomeren za oba reporterska proteina tekom temperaturne spremembe (iz 30°C na 37°C). 
Za tvorbo natančnejših obročastih vzorcev, kjer je izražanje sfGFP in mRFP pod strogo kontrolo, so uvedli nadzor z negativno povratno zanko z LacI ter oznako za razgradnjo AAV. Pri tem je postala barva prvega zelenega obroča (najbolj v notranjosti) bolj razločna in mešanje z rdečo barvo je bilo zmanjšano. Izražanje reporterskih proteinov se je zmanjšalo, ko je kolonija dosegla stacionarno fazo rasti, kar se je pričakovano odražalo tudi na intenziteti fluorescence. Raziskovalci so s tem poskusom pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala in spremembo temperature nadzorujemo in uravnavamo izražanje genov [6].

===Spreminjanje celične morfologije s toplotno regulacijo===
V tem poskusu so raziskovalci uporabili prototip T-stikala za uravnavanje izražanja genov, povezanih z morfologijo celic. Za razliko od prejšnjega poskusa v tem primeru torej niso uravnavali izražanja reporterskih proteinov, saj so jih zamenjali s proteini, ki vplivajo na morfologijo celic. Pri tem so vključili gen za protein MreB, ki je odgovoren za tvorbo oblike celice, in gen za protein FtsZ, ki je odgovoren za celično razdelitev po podvojitvi jedra. Oba gena omogočata tvorbo paličastih, nitastih ali sferoidnih oblik celic. Do sferoidne oblike je prišlo pri prekomernem izražanju mreB (pri 30°C), do nitastih struktur pa ob prekomernem izražanju ftsZ (pri 37°C) [6].

===Tvorba biopolimerov===
Metabolno inženirstvo že dolgo izkoriščamo za povečano proizvodnjo želenega produkta. V ta namen lahko izkoriščamo tudi pripravo vezij z dinamičnim nadzorom, s katerim lahko uravnavamo tarčne poti, za povečano akomulacijo želenih bioproduktov. To je pogosto uporabljen postopek za učinkovito pridobivanje želenih produktov, pri katerem je faza rasti celic ločena od faze produkcije (Lv et al., 2019). Družina polihidroksi alkanoatov (PHA) predstavlja biorazgradljive biopolimere, ki jih sintetizirajo določeni mikroorganizmi. Imajo različne termo-mehanične lastnosti, ki so odvisne od sestavin gojišča, v katerem nastajajo, njihove molske mase in načinov polimerizacije – na ta način lahko njihovo sintezo tudi prilagajamo. Za sintezo PHA so avtorji članka združili in polimerizirali dve PHA biokocki, in sicer PHB in P4HB, poimenovali pa so ju PHB-b-P4HB.  Sinteza tega produkta poteka preko sintezne poti, v kateri glukoza nastopa kot edini vir ogljika. Sintezna pot je razdeljena v 3 module: sinteza 3-hidroksibutirat-CoA, sinteza 4-hidroksibutirat-CoA in konstitutivno izražanje PHA sintaze (PhaC), ki omogoča neprestano polimerizacijo. Pri tem lahko sintezo obeh intermediatov (PHB in P4HB), ki sta pod kontrolo promotorja tac, sprožimo z dodatkom IPTG.  Na podlagi uporabe T-stikala je raziskovalni skupini torej uspelo uravnavati izražanje dveh samostojnih metabolnih poti za sintezo 3HB-CoA in 4HB-CoA, s čimer so dobili polimer PHB-b-P4HB [6].

== '''Zaključek''' ==
Termo stikalo, ki temelji na temperaturno-odvisni regulaciji izražanja proteinov, predstavlja zelo učinkovito in uporabno strategijo za nadzorovano prepisovanje več genov, ki jo lahko prenesemo na industrijsko raven [2]. Avtorji članka so pokazali, da lahko s pomočjo T-stikala uravnavamo in spreminjamo morfologijo celic in barvne vzorce kolonij. Velik korak naprej, ki je tudi pomemben za pridobivanje industrijsko pomembnih bioproduktov, pa predstavlja tudi možnost biosinteze makromolekul s pomočjo znanja sintezne biologije, saj so tovrstna genetska vezja učinkovita, poleg tega pa zagotavljajo široko uporabnost. 

== '''Viri'''==
[1.] Elvin, C. M., Thompson, P. R., Argall, M. E., Philip Hendr, N., Stamford, P. J., Lilley, P. E., & Dixon, N. E. (1990). Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene, 87(1), 123–126. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90503-J

[2] Harder, B. J., Bettenbrock, K., & Klamt, S. (2018). Temperature-dependent dynamic control of the TCA cycle increases volumetric productivity of itaconic acid production by Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering, 115(1), 156–164. https://doi.org/10.1002/bit.26446

[3.] Holtz, W. J., & Keasling, J. D. (2010). Engineering Static and Dynamic Control of Synthetic Pathways. In Cell (Vol. 140, Issue 1, pp. 19–23). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.12.029

[4.] Li, Z. J., Shi, Z. Y., Jian, J., Guo, Y. Y., Wu, Q., & Chen, G. Q. (2010). Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Metabolic Engineering, 12(4), 352–359. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2010.03.003

[5.] Lv, Y., Qian, S., Du, G., Chen, J., Zhou, J., & Xu, P. (2019). Coupling feedback genetic circuits with growth phenotype for dynamic population control and intelligent bioproduction. In Metabolic Engineering (Vol. 54, pp. 109–116). Academic Press Inc. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2019.03.009

[6.] Wang, X., Han, J. N., Zhang, X., Ma, Y. Y., Lin, Y., Wang, H., Li, D. J., Zheng, T. R., Wu, F. Q., Ye, J. W., & Chen, G. Q. (2021). Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nature Communications, 12(1), 1–13. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21654-x