Rizobakterijska simbioza
Setten L, Soto G, Mozzicafreddo M, Fox AR, Lisi C, Cuccioloni M, Angeletti M, Pagano E, Díaz-Paleo A, Ayub ND. Engineering Pseudomonas protegens Pf-5 for nitrogen fixation and its application to improve plant growth under nitrogen-deficient conditions. PLoS One. 2013 May 13;8(5) ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
UVOD: Fiksacija oz. pretvorba atmonsferskega dušika (N2) do amoniaka (NH3) je proces, ki poteka v prostoživečih in simbiontskih talnih bakterijah. Za fiksacijo je ključen nitrogenazni kompleks, katerega aktivnost je omejena na anaerobne pogoje. Bakterije so razvile različne mehanizme, ki ščitijo nitrogenazo pred vplivom kisika. Poznamo več vrst bakterij, ki so zmožne fiksacije dušika v aerobnih in anaerobnih pogojih. Dušik je bistvenega pomena za rast in razvoj rastlin. Glavni cilj raziskav na področju fiksacije dušika je razvoj bakterijskih vrst, ki bi s fiksacijo dušika prispevale k izboljšanju produktivnosti nestročnic. Na žalost ne poznamo bakterije, ki bi lahko hkrati fiksirala dušik in živela v simbiozi z ekonomsko pomembnimi rastlinami (koruza, riž in pšenica). V agronomiji se veliko uporabljajo rizobakterije, ki izboljšujejo rast in odpornost nestročnic. Z genskim inžiniringom jim lahko uvedemo dodatno lastnost, t.j. fiksacijo dušika.
POVZETEK REZULTATOV IN METOD: V vseh bakterijah, ki so zmožne fiksacije dušika, najdemo gene nif, ki zapisujejo za strukturne, regulatorne in biosintezne komponente, ki ta proces omogočajo. Nekatere bakterije vsebujejo gene nif blizu skupaj na genomu v tako imenovanih otočkih, ki omogočajo fiksacijo dušika. Tak primer je bakterija Pseudomonas stutzeri A1501, ki so si ga raziskovalci izbrali kot donorski organizem genov nif. Za prejemne organizme so izbrali druge vrste bakterij iz istega rodu, saj so le te najbolj primerne za heterologno ekspresijo nitrogenaze. Izbrani prejemni organizmi so: Pseudomonas protegens Pf-5, Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas veronii DSM11331, Pseudomonas taetrolens IAM1653, Pseudomonas balearica SP1402 in Pseudomonas stutzeri CCUG11256. Izmed izbranih omenjajo sev P. protegens Pf-5 kot najbolj zanimiv za transformacijo in uvedbo nitrogenaznega kompleksa. Ta sev živi v rizosferi širšega spektra rastlinskih vrst, kjer tekmuje za obstoj z nativnimi mikrobi, poleg tega pa se jo uporablja komercialno kot sredstvo za biološko kontrolo, saj pomaga rastlinam pri obrambi pred patogeni.
Najprej so z mutagenezo uvedli kaseto z markerjem za odpornostjo na kanamicin na genom donorskega organizma (A1501) nif genov v bližino otočkov, ki omogočajo fiksacijo dušika. V nadaljevanju so iz modoficiranega genoma pripravili kosmidno knjižnjico in z presejalnimi testi izolirali kozmid, ki je vseboval marker in otoček za fiksacijo dušika v vključku. Slednjega so poimenovali X940 in ga uporabili za transformacijo prejemnih sevov. Največji potencial je pokazal rekombinantni sev P. protegens Pf-5 X940, ki je zmožen visoke aktivnosti v smislu fiksacije dušika in posredovanja amoniaka v okolje. Njegov pozitivni učinek na več vrst rastlin (tudi ekonomsko pomembnih) so opazovali z dodajanjem rekombinantnega seva v gojišče rastlin in primerjavo produktivnosti le teh v odsotnosti in prisotnosti dušika. Ugotovili so, da vse analizirane rastline v kombinaciji z Pf-5 X940 kažejo povečano produktivnost glede na referenco.
DISKUSIJA IN ZAKLJUČEK: V preteklosti so rodu Pseudomonas pripisovali splošno lastnost nezmožnosti fiksacije dušika. V zadnjem času pa odkrivajo dokaze, ki so v nasprotju z nekdanjim mišlenjem. V zadnjih študijah omenjajo, da obstaja v rodu Pseudomonas več sevov, ki so zmožni fiksacije dušika, večina ostalih pa je za to lastnost dovzetnih, kar so pokazali v opisanem članku. Do adaptacije nitrogenaznega kompleksa v tem rodu naj bi prišlo z horizontalnim prenosom genomskih otočkov. Velja omeniti, da število esencialnih genov za sposobnost fiksacije dušika še ni znano. Teh genov je vsaj 16 in so ponavadi razpršeni po genomu, kar je raziskovalcem do danes oteževalo delo in s tem pripravo gesko spremenjenih bakterij, ki bi jim uvedli lastnost fiksacije dušika. Na podlagi uporabljene metodologije je v prihodnosti mogoče relativno enostavno pridobiti gensko spremenjeni mikroorganizem z uvedeno sposobnostjo fiksacije dušika. V članku napovedujejo tudi študije, ki bodo razkrile število in lastnosti esencialnih genov, ki omogočajo fiksacijo dušika. Ta model pa naj bi bil uporaben tudi za študije, ki bodo razkrile dodaten informacije o nitrogenaznem kompleksu (strukturo, način sestavljanja, regulacijo,...)
