S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami
UVOD
Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO2 je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].
Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O2 in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O2 v končnem izdelku [2].
Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO2 neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].
Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N2, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].
SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH
Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd) iz Lactococcus lactis, ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum in cianobakterije za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. Kivd je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO2, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].
NAČINI VNOSA DNA V CIANOBAKTERIJE
Učinkovit prenos eksogene DNA v cianobakterije lahko dosežemo z uporabo suicidalnih vektorjev za prenos kromosomskih genov. To vključuje integracijo DNA fragmenta v kromosome cianobakterij z dvojno homologno rekombinacijo in transformacijo samopodvajajočih plazmidov [5]. Za ohranjanje spremenjenega genotipa je pomembno, da je mutacija stabilna, kar pomeni, da mora biti v vseh kopijah kromosomov. Ta pogoj popolne segregacije genoma je dolgotrajen, saj je večina cianobakterij poliploidnih [5]. Ugotovljeno je bilo, da sta zmanjšanje koncentracije fosfata in agarja v rastnem mediju ter visoka temperatura ključni parametri za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije. Tekom raziskav so znanstveniki ugotovili, da se proces pospeši, če je v mediju nižja koncentracija fosfatov in nižja koncentracija agarja. Hkrati pa mora biti temperatura višja. Ti parametri so ključni za zmanjšanje poliploidije in pospešitev procesa segregacije [5].
Samopodvajajoče se plazmide in prenosne plazmide lahko uporabimo kot alternativo za izražanje heterolognih genov. Na ta način se zamudnemu procesu popolne segregacije. Prenosni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v E. coli in cianobakterijah, olajšajo kloniranje in vzdrževanje plazmidov. Njihovi glavni pomanjkljivosti pa sta ozek spekter območje gostiteljev in majhno število kopij na celico [5].
Seveda pa še obstaja konjugacija, elektroporacija in »naravna« transformacija.
Konjugacija
Konjugacija je zelo razširjena in pogosto uporabljena metoda za prenos DNA v cianobakterije. Zanjo je značilna visoka učinkovitost in širok spekter uporabnosti med različnimi vrstami. Pri konjugaciji se uporabita dva različna seva E. coli, in sicer pomožni sev, ki vsebuje konjugativni plazmid (ta nosi mob gene, potrebne za mobilizacijo genetskih elementov) in donorski sev, ki nosi pomožni plazmid, na katerem se nahaja izvor replikacije (oriT), zaporedje, potrebno za konjugacijo, in geni, jih želimo prenesti v cianobakterije. Nekatere vrste potrebujejo dodatne vektorje za optimizacijo učinkovitosti konjugacije [5].
Elektroporacija
Elektroporacija vključuje uporabo močnega električnega polja, ki ustvari pore v celični membrani cianobakterij. Doslej je bila elektroporacija uspešno uporabljena samo pri nekaterih vrstah cianobakterij. Optimalni pogoji (napetost in trajanje impulza) so vrstno specifični. V nekaterih sevih so elektroporacijo uspešno uporabili za vnost linearnih fragmentov DNA, vendar pa so ti fragmenti izpostavljeni razgradnji z nukleazami. Učinkovitost lahko povečamo z dodajanjem EDTA [5].
Naravna transformacija
Naravna transformacija opisuje privzem in vzdrževanje eksogene DNA. Pri cianobakterijah retraktilni pilus T4P vzpostavi stik z zunajcelično DNA in z retrakcijo vnese tujo DNA v celico. Znano je, da je več cianobakterij naravno kompetentnih. »Naravno« transformacijo je možno ustvariti tudi z genskim inženiringom. Uvedba gena pilN iz seva Syn7942 v Syn2973 je privedla do pridobitve sposobnosti naravne transformacije, čeprav z nižjo učinkovitostjo kot pri Syn7942. Učinkovitost privzema je odvisna od koncentracije in dolžine DNA, uporabljenega seva cianobakterije in faze rasti. Sposobnost Syn70020s in Syn68030s se drastično zmanjša od eksponentne do stacionarne faze. Opazili so tudi, da ima cirkadiani ritem tudi vlogo pri učinkovitosti transformacije cianobakterij, in sicer geni za pile so prekomerno izraženi v temi ali slabih svetlobnih pogojih. Posledično se s tem poveča tudi kompetentnost cianobakterij v temi [5].
MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH
Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je E. coli, ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v E. coli, ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].
Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.
Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz E. coli. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcS, efektorskega elementa CcR ter promotor PcpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz E. coli so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja PFNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].
VPLIV INTEGRACIJE SISTEMA, INDUCIBILNEGA Z ZELENO SVETLOBO, NA EKSPRESIJO BUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST
V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].
Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo Synechocystis sp. PCC 6803. V E. coli K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].
Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem PcpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja PcpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz L. lactis, ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom E. coli K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma Synechococcus sp. PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].
Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in PcpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol m−2 s−1) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol m−2 s−1). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem PcpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].
ZAKLJUČEK
Viri
[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.
[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.
[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.
[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.
[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.
