Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov

From Wiki FKKT
Revision as of 17:59, 11 December 2016 by Petra Tavčar (talk | contribs)
Jump to navigationJump to search

FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing

Efektorske nukleaze podobne transkripcijskim aktivatorjem (TALEN) so poleg nukleaz s cinkovimi prsti in sistema CRISPR/Cas9 eno izmed glavnih orodij za urejanje genomov pri različnih celicah in organizmih. Priprava TALEN-ov je zamudna in draga, poleg tega večina poznanih metod omogoča sestavljanje konstruktov z omejenim številom TALE-ponovitev. Metoda FLASH, ki so jo avtorji članka razvili in podrobno opisali, je v primerjavi z ostalimi metodami hitrejša, cenejša in omogoča avtomatizirano sestavljanje zapisov s poljubnim številom TALE-ponovitev na trdnem nosilcu. Avtorji so z uporabo metode FLASH sestavili raznolik nabor TALEN-ov in testirali njihovo delovanje na EGFP genu ter večih človeških genih, ki so udeleženi pri rakavih obolenjih in epigenetski regulaciji.


Uvod

Zgradba TALEN-ov

TALEN-i vsebujejo DNA-vezavno domeno in nukleazno domeno. DNA-vezavna domena izvira iz efektorjev TAL. To so sekrecijski proteini pri bakterijah iz rodu Xanthomonas, ki se ob napadu bakterij na gostiteljsko rastlino izločajo v notranjost rastlinskih celic, v jedru se vežejo na DNA in vplivajo na transkripcijo gostiteljevih genov, kar poveča patogenost bakterij. Za njihovo DNA-vezavno domeno so značilne številne ponovitve ohranjenega zaporedja, ki je dolgo 33-35 aminokislinskih ostankov. Znotraj zaporedja sta AK-ostanka na 12. in 13. mestu variabilna. Omenjeni dipeptidni motiv je odgovoren za prepoznavanje posamezne baze na zaporedju DNA. Število TALE-ponovitev znotraj domene določa dolžino zaporedja, ki ga DNA-vezavna domena prepozna. Zadnja TALE ponovitev je polovične dolžine in vsebuje variabilen dipeptidni motiv. Pred in za zaporedjem ohranjenih TALE-ponovitev sta N- in C- končni domeni, ki se ne prilegata DNA. Nespecifična nukleazna domena TALEN-ov izvira iz endonukleaze FokI in se nahaja na C-koncu proteinov. V tehnologiji TALEN se pogosto uporablja FokI domena divjega tipa, obstajajo pa tudi mutirane variante, ki omogočajo boljšo specifičnost in/ali nukleazno aktivnost.


Delovanje TALEN-ov

Število in sosledje TALE-ponovitev v DNA-vezavni domeni določata, katero zaporedje na DNA bo TALEN prepoznal. Nespecifična FokI nukleazna domena pa omogoča cepitev verige DNA. Posamezen TALEN cepi le eno verigo DNA, zato je potrebno pri uvajanju zlomov dvojne vijačnice uporabiti par TALEN-ov, pri čemer se vsak veže na svojo DNA-verigo tako, da se FokI domeni približata. Do cepitve pride na odseku DNA med obema nukleaznima domenama. Da je prišlo do dvojnega zloma DNA zaznajo celični popravljalni mehanizmi, ki skušajo napako popraviti. Mehanizem popravljanja lahko poteče preko nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ) ali homologne rekombinacije (HR). NHEJ običajno vodi do uvedbe delecij ali insercij na mestu dvojnega zloma DNA, kar pogosto povzroči izgubo funkcije gena. S HR pa lahko v prisotnosti donorske DNA-matrice uvedemo specifične substitucije in insercije.