Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
Line 5: Line 5:


Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:
#1. nastanek jedra
# nastanek jedra
#2. oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine
# oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine
#3. pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture
# pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture
#4. sklopitev repnih proteinov.
# sklopitev repnih proteinov.


Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3, in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.
Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3, in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.
Line 30: Line 30:
===Sklopitev repnih proteinov===
===Sklopitev repnih proteinov===


Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.  
Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.


==Zgradba kompleksa portalnega proteina==
==Zgradba kompleksa portalnega proteina==

Revision as of 02:18, 5 May 2020

Kompleksi portalnih proteinov so posebne strukture, ki so se razvile pri dsDNA bakteriofagih iz reda Caudiovirales. Ti kompleksi, razporejeni v obliki dodekamernih obročev, igrajo posebno vlogo pri uspešnosti virusne okužbe, saj so ključnega pomena pri sestavljanju bakteriofaga, pakiranju bakteriofagne DNA in dostavi DNA gostiteljski celici.


Sestavljanje bakteriofaga

Sestavljanje fagnih delcev lahko razdelimo na štiri ključne faze, in sicer:

  1. nastanek jedra
  2. oblikovanje prokapside, ki vsebuje ogrodne proteine
  3. pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture
  4. sklopitev repnih proteinov.

Portalni protein igra pomembno vlogo v fazi 1, 3, in 4. Pri sestavljanju bakteriofaga so poleg portalnega proteina bolj pomembni še plaščni ter ogrodni proteini.

Nastanek jedra

Portalni protein deluje kot nekakšen kanal za DNA. Vendar je najprej potrebno, da se monomeri sestavijo v kompleks portalnega proteina (v nadaljevanju omenjeni tudi samo kot portalni protein) in vgradijo v eno oglišče prokapside. V prvi fazi mora priti do združitve portalnega proteina in ogrodnih proteinov skupaj s plaščnimi v ikozaedrično prokapsido. Taka prokapsida je sestavljena iz pentamerov in heksamerov, ki vsebujejo dodekamerni portalni protein. Nastanek tega kompleksa je odvisen predvsem od ogrodnih proteinov.

Ko se oblikujejo dodekamerni obroči, le-ti sodelujejo kot iniciatorji nadaljnjega sestavljanja. Znano je, da prisotnost portalnega proteina pri sestavljanju kapside pri nekaterih bakteriofagih poveča izkoristek le-tega procesa sestavljanja. Ojedritev pri bakteriofagih poteka različno, v vsakem primeru pa pride do tega, da se ogrodni protein nahaja na notranji strani prokapside.

Znano je, da ni nujen za izgradnjo prokapsid. Njegova prisotnost postane ključnega pomena pri pakiranju DNA, saj le-ta proces ne more poteči v njegovi odsotnosti. Le bakteriofagi, ki torej vsebujejo tak kompleks lahko zapakirajo ustrezno količino DNA in tako uspešno delujejo.

Oblikovanje prokapside

V tej fazi pride do izgradnje nezrele ikozaedrične kapside. Ogrodni proteini se še nahajajo znotraj prokapside. V prokapsidi se nahajajo tudi posebni proteini, ki kasneje pomagajo pri sprostitvi DNA.

Pakiranje bakteriofagne DNA, odstranitev ogrodnih proteinov in zorenje strukture

Sledi pakiranje DNA in zorenje prokapside. Ob tem se iz notranjosti prokapside sprostijo ogrodni proteini. Ti se lahko razgradijo (pri bakteriofagih lambda, T4, HK97 in herpes virusih) ali se ponovno uporabijo za sestavljanje fagnih delcev. Virusna DNA se selektivno veže na virusne terminaze, nato pa se dostavi v kapsido skozi portalni kompleks. Proces pakiranja je natančneje razložen spodaj (glej DNA pakirajoči motor bakteriofagov).

Sklopitev repnih proteinov

Po končanem pakiranju DNA je glavo nastajajočega bakteriofaga potrebno še ustrezno zapreti. Pri tem sodelujejo čepni proteini, ki interagirajo s portalnim proteinom in preprečijo, da bi DNA zapustila kapsido. Na koncu se na te proteine dodajo še repni proteini, ki se polimerizirajo. Le-ti imajo pomembno vlogo pri prepoznavanju celičnih receptorjev.

Zgradba kompleksa portalnega proteina

Strukturno so kompleksi portalnih proteinov dodekamerni obroči (12 podenot) in so del ikozaederične kapside. Vsaka kapsida ima na enem izmed svojih dvanajstih oglišč, ki je stičišče petih ploskev, prisoten portalni dodekamerni obroč. Je središče za pritrditev repa in proteinov, ki omogočijo zaprtje virusnega delca.

Čeprav se monomeri portalnih proteinov različnih virusov precej razlikujejo po velikosti (od 0,4 do 1 Mda), si vsi delijo podobno zvitje kljub zelo nizki podobnosti primarnega aminokislinskega zaporedja. Ta je običajno zgolj okrog 12%. Tako funkcija portalnih proteinov temelji predvsem na njihovem zvitju in strukturi.

Zanimivo je opažanje, da in vitro obstajajo različne oligomerne oblike (11-meri, 12-meri in 13-meri). Kar nakazuje na to, da so monomeri portalnih proteinov zgrajeni, tako da se lahko prilagodijo znatnim strukturnim spremembam. Strukturno je ta plastičnost lahko pojasnjena s prisotnostjo pozitivno in negativno nabitih zaplat na protomerih portala, ki interagirajo preko elektrostatskih sil in delujejo kot molekularni magneti. Posledično je možen nastanek različnih oligomerov.

Vsak monomer in tudi celoten dodekamer ima vsaj štiri, nekateri pa pet značilnih regij.

Regija sodčka

Portalni obroči imajo lahko dodatno regijo sodčka, ki je pritrjen na krono in se razširja v notranjost kapside. Prisoten je pri bakteriofagih T4 in P22. Pri P22 je prisoten le pri popolnoma dozorelih virusih. Gre za vijačno strukturo. Regija sodčka pri posameznem monomeru portalnega proteina vsebuje eno alfa vijačnico. Pri bakteriofagih P22 je ta dolga kar 125 aminokislin. V tej regiji je najpogostejša aminokislina glutamin (17%), ki je tudi pogost aminokislinski ostanek pri DNA vezavnih proteinih.

Regija krone

Regija krone je širok konec (če ni prisotne regije sodčka) portalnega proteinskega kompleksa in sega v notranjost virusne kapside. Sestavljena je iz alfa vijačnic. Poleg regije krila, s katero je fleksibilno povezana, gre za najbolj variabilno regijo portalnega proteina.

Regija krila

Regija krila mogoča tesno povezavo s kapsido in ogrodnimi proteini. Štrli navzven iz centralne osi. Najdaljša alfa vijačnica v domeni predstavlja hrbetenico krila. Na obrobju pa ima alfa/beta podzvitje. Ploščata površina krila je prevladujoče negativno nabita. To prepreči vezavo DNA na portal. Velikosti domene krila lahko segajo od 33 kDa (HK97-podobni virusi) pa vse do 80 kDa (P22). Povezano je s steblom preko fleksibilne zanke. Gre za neurejen element prisoten pri poznanih kompleksih nekaterih fagov. Zanke vsakega od protomerov prodirajo proti centru portalnega kanala in tako ustvarijo zožitev v obroču. Ta ima ključno vlogo pri preprečevanju uhajanja DNA pri pakiranju.

Regija stebla

Tako kot pecelj je tudi regija stebla strogo urejena. Tipično ga sestavljata dve alfa vijačnici in zunanje zanke. Alfa vijačnice, ki tvorijo steblo so glede na center kanala zasukane za kot od 30° do 50°, odvisno za kateri virus gre. Mutacije v vijačnici stebla imajo velik vpliv na DNA pakiranje. Pri P22 spremenjeni aminokislinski ostanki 105-132 rezultirajo v prekomernem pakiranju. Ravno obratno pa se zgodi pri SPP1, pri katerem mutacije povzročijo ustavitev pakiranja.

Regija peclja

Domena peclja je izpostavljena zunanjosti kapside. Vključena je v vezavo terminaze in predstavlja mesto za interakcijo z adapterskimi proteini. Je strogo urejena. Predstavlja začetni del kanala za DNA pakiranje. Pri portalnem kompleksu bakteriofaga T4 pozitivne aminokisline obdajajo dno regije peclja in so najverjetneje vpletene v ujetje DNA ob pričetku translokacije virusnega genoma.

DNA pakirajoči motor bakteriofagov

Da se v kapsidi bakteriofagov na omejenem volumnu razporedi negativno nabita DNA, je potrebno usklajeno delovanje portalnega proteina s terminaznim kompleksom, ki ga sestavljata mala in velika terminazna podenota. Terminazni kompleks in portalni protein skupaj tvorita molekulski motor, ki pretvarja kemijsko energijo, ki se sprosti pri hidrolizi ATP, v fizično gibanje molekul, zaradi česar pride do vstavitve DNA v prokapsido. DNA se v prokapsido vstavi s hitrostmi do ∼1,800 bp na sekundo in v korakih po 2 bp/ATP. Preko kanala premera 30 Å, ki ga tvori portalni protein, se v prokapsido translocira linearen genom, kjer se zelo tesno pakira v kompaktno strukturo. DNA pakirajoči motor bakteriofagov je najmočnejši do zdaj poznani molekulski motor in generira ogromne sile (do 60 pN). Tako velike sile so ključne za pakiranje DNA proti ogromnim elektrostatskim odbojnim silam in neugodni entropiji.

Mala terminazna podenota prepozna genomsko DNA, na kompleks male terminaze in DNA se naloži velika terminaza in nato se celoten kompleks naloži na portalni protein. Velika terminaza interagira z regijo pecelj portalnega proteina in oligomerizira, pri čemer tvori pentamerni obroč. Sestavljena je iz endonukleazne C-končne domene, ki je odgovorna za cepitev DNA, ter ATPazne N-končne domene, ki prispeva energijo za pakiranje DNA. Številni bakteriofagi podvojujejo genom po principu kotalečega se kroga in tvorijo dolge konkatemere. Prepoznavanje DNA in njena cepitev pa se med različnimi bakteriofagi razlikuje. Pri nekaterih bakteriofagih, kot so P22, T4 in SPP1, pride do začetne nespecifične cepitve blizu prepoznavnega mesta pac (angl. packaging recognition site). Ko je kapsida polna, se pakiranje genoma konča in pride do nespecifične cepitve DNA. Da ti bakteriofagi zagotovijo, da vsaka kapsida vsebuje celoten genom, je zanje značilna terminalno redundančna DNA. Drug mehanizem, do katerega pride pri bakteriofagih λ, HK97 in P2, pa je cepitev na specifičnih kohezivnih končnih mestih (cos), tako da se celoten genom nahaja med dvema cos cepitvenima mestoma. Bakteriofag φ29 pa ne potrebuje cepitve, saj je njegov genom že končne dolžine. Posebnost bakteriofaga φ29 je tudi, da za pakiranje DNA potrebuje šest molekul pRNA (pakirajoča RNA), ki so dolge 174 nukleotidov, in katerih sekundarna struktura je ključna za pakiranje DNA ter imajo homologno vlogo kot mala terminaza, potrebne pa so tudi za nalaganje ATPaznega dela motorja.

Strukturne spremembe portalnega proteina pri pakiranju genoma

Ko so preučevali strukturne spremembe portalnega proteina bakteriofaga P22 pri pakiranju DNA, so ugotovili, da pakiranje DNA inducira prehod nezrelega asimetričnega portalnega proteina v zrel simetričen kompaktnejši portalni protein, pri čemer pride do povečanja premera osrednjega kanala s 25 Å na 40 Å, medtem ko se celoten premer portalnega proteina zmanjša z 200 Å na 170 Å. Samo prvotna oblika, ki je prisotna v nezrelem bakteriofagu, pa je sposobna pakiranja DNA.

Regija sodček zaradi pakiranja genoma spremeni konformacijo iz nestrukturirane v alfa vijačno in zaznava pritisk v kapsidi. Do največje strukturne spremembe pride na C-končnem delu regije sodček, ki v zreli obliki sega precej bolj v notranjost kapside. Med pakiranjem DNA pride zaradi prevladovanja negativno nabitih aminokislinskih ostankov na zunanji površini regije sodček do odboja med DNA in negativnimi ostanki, zato se ta regija iztegne. Ta strukturna sprememba je najverjetneje ključna za injiciranje genoma ob infekciji.

Strukturna sprememba se zaradi visokega pritiska prenese iz regije sodček na regiji pecelj in krilo, in posledično pride do preureditve simetrije portalnega proteina iz petdelne v šestdelno. Ta preureditev simetrije predstavlja signal za terminacijo pakiranja in vodi v zmanjšanje vezavne afinitete za veliko terminazo, kar upočasni translokacijo DNA in pospeši nukleazno aktivnost velike terminaze. Velika in mala terminaza se ob zaključku pakiranja DNA sprostita z nascentnega bakteriofaga, zato v zrelem bakteriofagu nista prisotni.

Viri

P. E. Prevelige, J. R. Cortines: Phage Assembly and the Special Role of the Portal Protein. Curr. Opin. Virol. 2018, 31, 66–73.

V. B. Rao, M. Feiss: The Bacteriophage DNA Packaging Motor. Annu. Rev. Genet. 2008, 42, 647–681.

C. L. Dedeo, G. Cingolani, C. M. Teschke: Portal Protein: The Orchestrator of Capsid Assembly for the DsDNA Tailed Bacteriophages and Herpesviruses. Annu. Rev. Virol. 2019, 6, 141–160.

R. K. Lokareddy, R. S. Sankhala, A. Roy, P. V. Afonine, T. Motwani, C. M. Teschke, K. N. Parent, G. Cingolani: Portal Protein Functions Akin to a DNA-Sensor That Couples Genome-Packaging to Icosahedral Capsid Maturation. Nat. Commun. 2017, 8.

A. A. Aksyuk, M. G. Rossmann: Bacteriophage Assembly. Viruses. 2011, 3, 172–203.