Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA

Izhodiščni članek: Self-feedback loop-containing synthetic mRNA switches for controlled microRNA sensing

Uvod

Organizmi s kombinacijo uravnavanja izražanja proteinov na transkripcijski in translacijski ravni dosežejo želene prilagoditve, ki jim omogočijo preživetje v različnih okoljih. Zato v sintezni biologiji obstaja potreba po kompleksnejših sistemih, s katerimi bi povečali možnost aplikacij. Velik potencial ima uporaba mRNA: omogoča dinamično in hitro uravnavanje, ponuja se možnost modifikacije baz, za razliko od DNA uporaba predstavlja veliko manjšo nevarnost integracije v genom, poleg tega pa jo lahko v celice vnesemo na različne načine: s transfekcijo z linearno, samopodvajajočo in cirkularno mRNA ter plazmidno DNA[1].

RNA-stikala, ki se odzivajo na miRNA so sestavljena iz RNA-stikal in zaporedja, komplementarnega miRNA. RNA-stikala so deli RNA, ki vežejo ligand, s tem pa na transkripcijski, translacijski in/ali ravni izrezovanja intronov uravnajo izražanje proteinov[2]. Avtorji članka so si stikalo zamislili kot pozitivno oz. negativno povratno zanko iz aptamera MS2 (aptamer iz faga MS2) in plaščnega proteina MS2 (MCP), ki se nanj veže z visoko afiniteto (Kd = 0,2 nM), ter ima na C- oz. N-koncu fuzijski protein. Slednji ojača raven translacije (pozitivna povratna zanka) ali pospeši razgradnjo mRNA (negativna povratna zanka)[1]. Mikro-RNA (miRNA) so 19-22 nukleotidov dolge nekodirajoče RNA, ki regulirajo izražanje mRNA. S proteini iz družine Argonavtov tvorijo RISC (z RNA inducirani kompleks za utišanje (genov)) in se vežejo na komplementarna zaporedja na mRNA, kar povzroči razgradnjo (v primeru (skoraj) popolnega ujemanja) oz. utišanje mRNA (v primeru nepopolnega prileganja)[3]. Pri eksperimentih so uporabljali miRNA-21, ki je znan tumorski marker. Povišan je pri rakastih celicah različnih vrst, njegove tarče pa so večinoma tumorsupresorji (npr. proteini iz družine Bcl-2)[4].

Metode

Za delo so potrebovali konstrukte mRNA (opisani v nadaljevanju), ki so jih pripravili tako, da so ustrezno plazmidno DNA prevedli v mRNA z in vitro transkripcijo, pri tem so uporabili standardne nukleozid trifosfate, z izjemo N1-metilpsevdouridin-5'-trifosfata (ojača vezavo miRNA in RNA-vezavnimi proteini na RNA). Mešanica je prav tako vsebovala kapo ARCA oz. Acap, po čiščenju pa so konstrukte obdelali s fosfatazo. Nato so z njimi transficirali celice HEK293 (uporabljene so bile v vseh poskusih, razen če je drugače navedeno) oz. HeLa ter kvantificirali fluorescenco uspešno transficiranih celic s pretočno citometrijo. Kot kontrolo za uspešnost transfekcije so uporabili mRNA iRFP670[1].

Rezultati

V primeru pozitivne povratne zanke je MCP v C-končni fuziji s proteinom VPg (z genomom povezani protein iz kalicivirusa), ki preko interakcije z iniciacijskimi faktorji močno poviša raven translacije. mRNA konstrukt na 5' koncu vsebuje Acap (kapa AP3G), ki onemogoča od kape odvisno translacijo, zato je raven translacije zelo nizka. Sledi aptamer MS2, zapis za reporterski protein EGFP (omogoča kvantifikacijo ravni izražanja), T2A (peptid Thosea asigna 2A; povzroči, da se polipeptidna veriga sprosti iz ribosoma in nadaljnjo translacijo), MCP, VPg in na 3' koncu poliA rep. Delovanje pozitivne povratne zanke so preverili tako, da so raven izražanja EGFP v celicah HEK293 primerjali z negativnima kontrolama (konstrukta brez MCP-VPg oz. brez VPg). Izražanje je bilo približno 25-kratno v primerjavi s kontrolama, torej je konstrukt deloval[1].

mRNA konstrukt, ki deluje kot negativna povratna zanka, je zgrajen na podoben način. Na 5' koncu je kapa ARCA (anti-reverzni analog kape; zelo visoka raven translacije), sledi zapis za EGFP, T2A, Scd6 (protein iz kvasovk, ki rekruitra RNA helikazo Dhh1 na 3' mRNA, to pa povzroči razgradnjo mRNA), MCP in 2 ponovitvi aptamera MS2 ter poliA rep na 3' koncu. Raven izražanja negativne povratne zanke je bila nižja od ravni izražanja kontrole brez MCP-Scd6 oz. brez Scd6, s čimer so potrdili delovanje konstrukta. Velja omeniti, da je bila raven izražanja kontrole brez Scd6 2-krat višja od kontrole brez MCP-Scd6. Tega v članku niso komentirali, nakazuje pa, da že sama interakcija MS2-MCP negativno vpliva na izražanje tega konstrukta[1]. Da bi ustvarili konstrukte s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA-21 so štiri ponovitve zaporedja, komplementarnega miRNA-21, so dodali na 3' konec pozitivne povratne zanke oz. na 5' konec negativne povratne zanke. Na ta način so omogočili uravnavanje izražanja glede na prisotnost miRNA-21: večja kot je njena koncentracija, manjšo raven izražanja bi pričakovali[1].

Izražanje EGFP s konstruktom pozitivne povratne zanke z zaporedjem, komplementarnim miRNA-21, so primerjali s kontrolo, ki je vsebovala kapo ARCA, zapis za EGFP, zaporedje, komplementarno miRNA-21, in poliA rep (EGFP stikalo). Izražanje reporterskega proteina za oba konstrukta so normalizirali na kontrolo brez dodane eksogene miRNA-21. Že pri najmanjši koncentraciji miRNA-21 (0,2 nM) so opazili signifikantno razliko med konstruktoma. Izražanje s konstruktom s pozitivno povratno zanko je bilo relativno nižje od kontrole, isti trend so opazili tudi pri višjih koncentracijah miRNA-21. Poskus so za koncentracije miRNA-21 0; 0,2 in 5 nM ponovili še za analogne konstrukte, ki imajo namesto para MS2-MCP, par aptamer PP7 (aptamer iz faga PP7)-plaščni protein PP7 (PCP). Za slednja je prav tako značilna visoka afiniteta (Kd = 1 nM), rezultati so bili podobni. Uporaba torej ni omejena na specifične pare aptamer-RNA-vezavni protein, ampak je ta princip splošno uporaben, pod pogojem, da je afiniteta dovolj visoka[1].

Zaradi spodbudnih rezultatov so poskus izvedli na dveh vrstah celic (brez eksogeno dodane miRNA-21). Poleg HEK293 so uporabili tudi HeLa, za katere velja, da imajo v primerjavi s celicami HEK293 visoko raven izražanja endogene miRNA-21. Poleg EGFP stikala so celice transficirali tudi z mRNA EGFP in iRFP (oba konstrukta sta vsebovala kapo ARCA, ne pa tudi komplementarnega zaporedja miRNA-21). Izražanje EGFP pri pozitivni (mRNA EGFP) in negativni (mRNA iRFP) je bilo v obeh vrstah celic primerljivo. Izražanje reporterskega proteina pri EGFP stikalu je bilo 12-krat višje pri HEK293 v primerjavi s celicami HeLa. Še večja razlika v izražanju pa je bila v primeru pozitivne povratne zanke, kjer je bila razlika 40-kratna v prid HEK293. Iz tega lahko sklepamo, da je prišlo do ojačanja signala preko pozitivne povratne zanke, saj je raven izražanja miRNA-21 v HeLa celicah višja le za faktor 17. Poleg tega je bila raven izražanja pri HeLa primerljiva z izražanjem negativne kontrole, torej praktično nič, raven pri HEK293 pa je bila zmanjšana v primerjavi s pozitivno kontrolo. S tem so pokazali, da lahko z RNA-stikalom, ki se odziva na miRNA, z dovolj visoko koncentracijo miRNA-21 pridemo do praktično binarnega odziva sistema, obenem pa je tako občutljivo, da lahko zaznamo zelo nizke koncentracije miRNA-21[1].

Nato so poskuse izvedli s konstruktom negativne povratne zanke z zaporedjem, komplementarnim miRNA-21. Za kontrolo so uporabili EGFP stikalo (opisano zgoraj). Izražanje reporterskega proteina za oba konstrukta so normalizirali na kontrolo brez dodane eksogene miRNA-21. Pri vseh dodanih koncentracijah miRNA-21 so opazili, da je raven izražanja konstrukta z negativno povratno zanko veliko višja kot pri EGFP stikalu. Da bi se prepričali, da izbor miRNA ni vplival na rezultate, so analogen poskus ponovili še z miRNA-302 (miRNA, ki ima vlogo pri diferenciaciji, razvoju in preživetju celic), meritve pa so pokazale isti trend. Dobljene rezultate so razložili tako, da je bilo zaradi miRNA zmanjšana koncentracija konstrukta, s tem pa je bilo zmanjšano tudi delovanje negativne povratne zanke (preko Scd6). Posledično se je podaljšal razpolovni čas mRNA, kar je na koncu pomenilo višjo relativno raven izražanja reporterskega proteina[1].

Zaključek

RNA-stikala, ki se odzivajo na miRNA, so torej nov način uravnavanja izražanja proteinov. Potencial imajo predvsem tista s pozitivno povratno zanko, s katerimi je možno doseči odziv 'vse ali nič', hkrati pa so dovolj občutljiva, da zaznamo tudi zelo nizke koncentracije miRNA[1]. To bi lahko uporabili tako v terapevtske (npr. uravnavanje izražanja proteinov in s tem preživetja celic glede na izražene miRNA) kot v analizne namene (npr. zaznavanje miRNA za namen identifikacije celic, ki bi bila lahko alternativa pretočni citometriji)[1],[5].

Viri

[1] Z. Liang, K. Tan, C. Yin Li, Y. Kuang: Self-feedback loop-containing synthetic mRNA switches for controlled microRNA sensing. Bioorganic Chemistry 2024, 144, 107081. [2] K. Kavita, R. R. Breaker: Discovering riboswitches. Trends Biochem Sci 2023, 48, 119–141. [3] H. Iwakawa, Y. Tomari: The Functions of MicroRNAs. Trends in Cell Biology 2015, 25, 651–665. [4] mIRN21. Wikipedia; 2023. [5] Y. Fujita, M. Hirosawa, K. Hayashi, T. Hatani, Y. Yoshida, T. Yamamoto, H. Saito: A versatile and robust cell purification system with an RNA-only circuit composed of microRNA-responsive ON and OFF switches. Science Advances 2022, 8, eabj1793.